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诊断肺部感染性疾病的金标准是什么？ 痰涂片检查发现哪些细菌有确诊价值？ 哪些标本需要冷藏保存、哪些必须室温？ 弱抗酸染色可检测哪些病原体？ 呼吸道标本培养到曲霉是否可以诊断曲霉感染？ 培养出马尔尼菲青霉是否可以确诊？ 下呼吸道标本分离培养到非典型病原体是否可以确诊？ 宏基因组测序结果，序列数高就一定是感染吗？ 序列数低也并非一定不是致病原？ 最近，中华结核和呼吸杂志发表了《成人呼吸系统感染性疾病病原学诊断专家意见》，乃呼吸科医生年度必看专家意见，对临床医生帮助非常大，下面和各位小伙伴分享其中的精华内容。 看完这个专家意见，以后我们送检微生物、使用抗生素会更加明智、更加规范。 标本采集相当于盖第一层楼，这个地方出错了，后面的结果就很难准确的分析。 组织活检标本是诊断肺部感染性疾病的金标准。 首先选择非侵入性方法（无创或微创检查），假如非侵入性方法不能确诊，必要时选择有创检查方法。 特别注意的是，对于胸腔积液标本采集：标本量方面，细菌培养≥1 mL，真菌培养≥10 mL，分枝杆菌培养≥10 mL，结核T-SPOT检查需要添加抗凝剂。 严格无菌操作：个人觉得，从引流管抽取胸水行微生物检查的价值非常有限，胸水培养最好在胸腔穿刺时留取标本。 尽快送检标本，应在采样后2小时内送达实验室，样本量少的标本应于30分钟内送检，要不然标本很可能干涸，微生物都死翘翘了，送去检验科也没用。 常见标本，除了病毒转运培养基（行病毒培养）需要冷藏保存外，其他的标本包括病毒拭子转运管、血培养、痰培养等等，全部都是室温保存后，2 h内送检。 组织液、体液、灌洗液等标本行细菌培养，以及病毒转运培养基，需要立即送检。 弱抗酸染色可检测奴卡菌；肺孢子菌不能培养，只能行六胺银染色、核酸检测及抗原检测；寄生虫感染也不能培养，只能显微镜下检查，或行核酸检测及抗原检测。 测定药物敏感度的方法主要有以下三种： 自动化检测技术：通量高，比传统方法更加快速。 分子生物学方法：直接对耐药基因进行检测，但是大多数细菌的耐药有多种因素参与，基因型与表型并不完全相同（比如没有测到耐药基因≠敏感），选择抗菌药物需综合分析。 4.1直接抗原快速检测 抗原检测可测细菌抗原（尿肺炎球菌抗原）、非典型病原体抗原（尿军团菌抗原），以及真菌抗原，例如1,3-β-D-葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖试验（GM试验），应注意假阳性和假阴性结果。 抗原快速检测病毒的敏感度低（假阴性率高），若临床高度怀疑病毒感染，应加做病毒核酸检测，以排查假阴性。 4.2血清特异性抗体检测 体液免疫缺陷的患者可呈假阴性，早期阳性率较低，需要采集急性期及恢复期双份血清进行评价（抗体滴度在恢复期较急性期升高4倍以上价值才大）。 新型冠状病毒肺炎的患者，在感染后3~5天即可检测到病毒特异性IgM，但是IgM阳性不一定就是新冠病毒感染，有可能是假阳性（所以现在不用抗体筛查感染者了，还是核酸更靠谱）。 4.3涂片检查 肺穿刺标本和胸腔积液涂片发现病原体对确诊具有重要意义（前提是标本没有被污染）。大家最熟悉的莫过于涂片查到抗酸杆菌，价值巨大，虽然不能区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，另外荧光涂片镜检查抗酸杆菌的敏感度高于传统的萋-尼染色。 涂片镜检发现寄生虫滋养体、包囊或卵囊、虫体、虫卵可作为确诊依据。改良抗酸染色可发现隐孢子虫卵囊，发现刚地弓形虫滋养体或包囊需要吉姆萨染色，比氏微孢子虫需要改良三色染色法，并殖吸虫虫卵、阿米巴原虫滋养体可直接涂片镜检。 念珠菌是口腔常见的定植菌，呼吸道标本涂片发现真菌孢子或菌丝时，应根据临床表现综合判断是定植还是感染。黏蛋白卡红染色可用于发现隐球菌，但不能作为隐球菌肺炎的诊断依据。 BALF（支气管肺泡灌洗液）或诱导痰，行六胺银染色或免疫荧光染色法镜检发现肺孢子菌，可作为肺孢子菌肺炎的确诊依据。合格痰标本、气管内吸引物、BALF或刷检标本镜检发现较为特异的菌丝（曲霉或毛霉丝）可作为诊断肺曲霉病、毛霉病的微生物学依据（注意，微生物学依据≠确诊），但涂片阳性率远低于培养阳性率。 合格下呼吸道标本分离到支气管炎博德特菌、土拉热弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌可以作为确诊依据；但镜检见到典型革兰阳性柳叶刀样双球菌，如果每个油镜视野中肺炎链球菌超过10个对诊断有参考意义。合格下呼吸道标本涂片镜检与培养结果一致（如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等）对诊断有重要参考意义。经气管导管吸引分泌物涂片革兰染色，若每个高倍镜视野检出2%以上白细胞有微生物吞噬现象，对病原学诊断有参考价值，可作为初始经验性抗感染治疗的依据。 4.4培养 微生物培养的前提是标本要合格。 肺组织活检标本培养阳性是诊断真菌感染的重要依据，但也要注意排除污染的可能。即使是下呼吸道分泌物、BALF（支气管肺泡灌洗液）也需除外定植或污染。 临床标本分离培养出马尔尼菲青霉是诊断该病的金标准。目前的研究显示，确诊肺组织胞浆菌病，需要组织学和微生物学检查同时发现该菌。新型隐球菌可以寄生于健康人群，隐球菌培养阳性可以作为诊断的重要参考依据，但应结合临床具体情况判断是否为感染。 痰标本培养连续2次分离到同种曲霉及BALF单次培养阳性可作为诊断肺曲霉病的微生物学依据（注意，微生物学依据≠确诊）。痰培养念珠菌阳性难以区分定植或感染，临床意义有限，即使保护毛刷标本培养阳性也不能作为诊断侵袭性肺念珠菌病的依据，但如果痰、诱导痰或BALF标本镜检时发现大量出芽菌体和念珠菌菌丝，提示念珠菌处于快速繁殖期，具有一定的临床指导意义。 病毒培养耗时长，阳性率偏低，不建议常规应用，主要用于科研。 下呼吸道标本分离培养到非典型病原体（支原体、衣原体等）可以确诊，但耗时长，阳性率偏低。 胸腔积液、肺活检标本培养到病原菌，下呼吸道标本培养出支气管炎博德特菌、土拉热弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌可作为确诊依据。前提是没有污染，比如从胸腔闭式引流管里面抽出的胸水，中心静脉导管里面抽的血就很难排除污染。 痰定量培养的细菌浓度≥107 cfu/mL、经气管内吸取物细菌培养浓度≥105 cfu/mL、BALF培养细菌浓度≥104 cfu/mL或保护性毛刷标本细菌培养浓度≥103 cfu/mL时，致病菌的可能性较大。 4.5核酸分子扩增检测和基因芯片检测 多重PCR使用多对引物同时扩增时，可能出现引物间相互干扰，影响其敏感度和特异度，造成假阴性或假阳性；核酸检测阳性结果需结合临床实际情况，分析究竟是定植菌还是致病菌。 4.6宏基因组测序和16S rRNA基因测序 16S rRNA测序可同时半定量检测样本中所有细菌（只能测细菌）的16S rRNA基因；宏基因组技术（NGS）可对样本中所有微生物（细菌、真菌、病毒、寄生虫等）的全基因序列进行测序，可以更准确地鉴定到细菌、真菌、病毒等各种病原体的种水平。 宏基因组测序（NGS）可覆盖几乎所有病原体（细菌、真菌、病毒、寄生虫等），简直就是王者无敌、雨露均沾，但仍有一定缺陷，如胞内菌感染（如结核分枝杆菌）因病原体或其核酸释放到体液中的含量较低，可能导致检测敏感度偏低；某些真菌的细胞壁较厚，破壁困难导致敏感度下降。 对于新冠病毒，宏基因组测序首先提示出新型病毒致病原的信息，后来的事情大家都知道了，虽然很遗憾，但是说明宏基因组测序前途无量。 宏基因组测序有种王者归来的感觉，但目前它还在研究之中，没有必要盲目跟风，因为它目前还有一个遗憾：宏基因组测序结果，序列数高并不一定是致病原，数目低也并非一定不是致病原，受标本中病原体数量、核酸提取量和测序数据量、标本中人源序列丰度等因素的影响，还是需要结合临床综合判断。 后记 本文首发：医学界呼吸频道 本文作者：云南省一院 孙丹雄 |
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