day6trizol法提取RNA全集合（材料-步骤-原理）

小梦想在努力 2020-09-25

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好的字体和排版是优秀公众号本来的属性，只是自己忽略了。这次决定改一下公众号字体和排版了，之前的太丑，不忍直视

搜索了一下微信，看到凉风有刃公众号这篇文章，教直接复制就会保留文字的格式，这么简单？？

什么是好的设计之公众号字体和字体排版

突然觉得改变也不是太难的事，如果你愿意去做，最后它会给你惊喜

好了，今天来讲一下 trizol法提取RNA那些事

之前一直埋头做实验，就听师兄说，没有理解原理就去做了实验，结果却总不理想，直到前天上生物信息学课，遇到一学霸，非常详细地给一同学介绍q-PCR ，从原理到用材用量,惊呆到了，所以昨天狠心下来去了解个透（说明多交流，你会学到不一样的经历的）

1.详细步骤：

材料：
Trizol ，氯仿，异丙醇，75% 乙醇（用RNase-Free 水配制）， RNase-Free 水，EDTA抗凝管。废弃缸，1.5ml EP管，EP管+抗凝管的托，大、中、小号枪和枪头、纸巾、棉花、手套

步骤：
300ul 全血+1ml TRIzol（充分吹打混匀，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）
+200ul的氯仿（静置5min ，离心=12000g， 4℃，15min）取上层上清液，转移到1.5ml EP 管中，
加500ul的异丙醇，（上下颠倒混匀10s，室温静置10min ，离心12000g， 4℃， 10min ，弃上清）
+1ml 75%乙醇，上下颠倒混匀10s，离心7500g， 4℃， 10min ，弃上清
室温下干燥5-10min （充分干燥不好溶解），加入11 ul的 RNase-free-water （充分溶解RNA ）

检测质量
260 nm、230 nm、280 nm的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值
▲分光光度计测OD值（取2μ l 进行电泳，其余-80℃保存）
▲分光光度计检测质量取出2 ul定量，测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)。A260/A280=1.8~2.1 此公式体现了RNA中蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.2间
A260/A280<1.8，说明蛋白质等有机物的污染比较明显
A260/A280>2.1，说明RNA存在降解，已经被水解成了单核苷酸

PS:
1.先加试剂，再加标本，实验会快一点
2.标本标签：术后标2，术前标1
3.师姐建议：
1.可加入与上清液等体积异丙醇；500-500
2.酒精洗涤2次；
3.加入异丙醇离心后，每管加300μl酒精，震荡至沉淀漂浮，然后再汇合成一管，离心5分钟，去上清，再加入1000ul酒精，再震荡至沉淀漂浮，再次离心5分钟。
4.干燥5分钟左右，不要让沉淀太干

2.原理

也是昨晚看的公众号文章，分子君爱生活 Mega18 两个公众号

提取RNA时小伙伴们应该掌握哪些原理(方法 TRIzol法上)

提取那点事-RNA

以下引用公众号：分子君爱生活

第一个试剂：TRIzoI，它的功能是使细胞充分裂解，溶解胞内含物，注意这一点就开始使RNA提取更纯的一个初始保证，同时又因为它里面含有RNαse抑制剂(就是RNA酶抑制剂，RNA酶很好理解是分解RNA酶的，我们提取RNA最讨厌遇到它)，能保持RNA的完整性。

第二个试剂：用三氯甲烷(即氯仿)，有毒，有强烈气味，需在通风厨内操作。加入氯仿，是因为氯仿是分子量较大的有机溶剂，可使有机相和无机相分离。DNA提取过程中，有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入无机相(即水相中)，但在提RNA时就应该避免它们两脱离，否则DNA会释放到水相，污染RNA，而氯仿本身对蛋白也有变性作用，剧烈震动会导致DNA的亲水基团，与水相接触，所以不要剧烈震动。