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xzc112发布于 10:55 我们都习惯把WB叫做'玄学'，意思就是这门技术让人琢磨不透，很难做到结果可重复，明明上了两个相同体积的同个样品，可总是这两个泳道的条带趋势不一致。然而，经过我一年半的摸索，我可以做到了这一点，我做WB 90%的结果都可以重复，所以我被我们实验室称为'WB之神'。今天我就想各位同行分享一下我的经验，需要的就看看，如果已经是'WB大神'的也请看看，欢迎指正！ 我们知道WB实验步骤繁琐，一次实验历时也不短，从提蛋白到显影结束可能要三天，我们就讲一下这里面的一些关键环节，就不面面俱到了。 一、蛋白提取及变性 1、提取蛋白 最重要的是防降解和保证蛋白浓度不要太低。防降解主要有两点，一是裂解前注意保持样品处于低温环境中，二是裂解时加入足够的蛋白酶抑制剂。接着是保证蛋白浓度，即要加入适量的裂解液，加太少会使蛋白提取不充分，加太多会让蛋白浓度太低，一般经验是这样的，细胞样品例如一个六孔板的细胞加60微升的裂解液，动物组织的话每毫克组织加10微升裂解液。 2、蛋白变性 加入上样缓冲液后100摄氏度煮10分钟，这里的上样缓冲液有两种可选，一种是用beta巯基乙醇打开蛋白质分子二硫键的，另一种是用DTT（二硫苏糖醇）。两者的作用是一样的，但特点不一样，前者更容易与氧气反应，稳定性比后者差，如果在常温下暴露在空中，前者只能维持24小时的活性，后者却可以维持7天左右。所以该如何选择？如果是蛋白样品较少，跑几次就可以用完的样品，这时选择beta巯基乙醇。如果样品很多，计划跑上几十次的，优先选择DTT,但也还建议变性后分装保存。 二、SDS-PAGE凝胶配制 1、配胶前准备 首先强调一下，一块好的胶是跑好蛋白的前提，所以这个环节也不容忽视。玻璃板的选择，一种是1毫米厚度的，另一种是1.5毫米的，这个厚度选择也是有讲究的，如果上样体积小于10微升，优先选1毫米，否则选1.5毫米的。原因是什么？答案在转膜部分揭晓。还有分离胶的浓度也要选择适合的。然后玻璃板和梳子要洗干净，晾干。装板，注意厚板和薄板的底部要对齐，否则会漏胶。加制胶的各成分前，要观察液体是否有沉淀，有沉淀的尽量不要用。 2、制胶 按配方说明依次加入各组分，加完SDS后先简单手动摇匀几下，然后迅速加入过硫酸铵和TEMED,紧接着就灌胶。然后我习惯用95%的酒精压胶，我也用过纯水，感觉纯水压没那么好，由于水的密度较大，会把分界处的胶压得膨大。静置25分钟后把酒精倒干，用吸水纸吸出多余的酒精，然后配压缩胶，同样的操作，关键是梳子要插得快，要小心梳子下产生气泡，然后静置30分钟。如果是当天跑胶，我会等上层胶凝2个小时再用。所以我一般提前一晚制胶。 三、蛋白电泳 1、上样前准备 找把胶组装到电泳芯上，注意密闭性，如果内槽漏液就不是匀强电场了，最后条带可能就不是一条直线。然后内槽倒满电泳液，拔梳子，这一步要小心，梳子要两边一起缓缓往上拔出，然后观察泳道内有无脱落的胶粒或者胶丝，有的话用1毫升注射器吸出。然后从冰箱取出蛋白样品，解冻。准备振荡器。 2、上样和电泳 注意，上样后蛋白会开始慢慢在胶中弥散，所以上样越快越好。我习惯先上蛋白Marker,再上蛋白样品，蛋白上样前确保样品完全解冻和充分振荡，吸的时候没有拉丝即可。上层胶80V 25分钟，下层胶120V 65分钟。 四、转膜 1、转膜前准备 我会在电泳结束前30分钟准备，把转膜液配好置于4度冰箱预冷，然后裁膜，准备转膜装置，准备碎冰和冰砖。最后把膜活化1分钟，然后转移至转膜液中。 2、转膜 组装转膜三明治夹，这一步很关键，最重要的是胶和膜之间不能有气泡，可以加多点转膜泡着。组装好后加满转膜液，设置电源参数，我习惯恒流转膜，200-280毫安，1-2小时，根据分子量定。如果一个电源带两个转膜大槽即四块胶，我就会用恒压70-110V。这个过程最重要的是做好降温。这里简单说一下蛋白分子量与玻璃板厚度，分离胶的浓度，转膜电源参数的选择问题。如果是能用1毫米的玻璃板就不用1.5毫米的，因为转膜是在电场的作用下蛋白分子从胶上迁移到膜上，1毫米胶的蛋白迁移距离要比1.5毫米的短1/3。选择更薄的胶蛋白转膜时间可以减少，从而减少发热，以免胶变形，条带也会更好看。然后是分离胶的浓度，如果是150KD以上的分子选10% 以下的的分离胶，200KD以上的选8%的，转膜条件用280毫安，120分钟足矣。 五、封闭孵一抗 1、封闭 转膜结束后，把膜先用TBST泡洗两遍再用5%脱脂奶粉或者BSA室温封闭1-2小时。注意一定要让蛋白面充分接触封闭液。 2、孵一抗 脱脂奶粉封闭的话，要用TBST泡洗三遍在转移至一抗溶液中，BSA封闭的可以直接转移至一抗中。如果膜的宽不大于8毫米，我习惯置于15毫升离心管中孵育，两条膜'背对背'式放置于一个管子里（3毫升液体即可）。如果大于8毫米，就用普通的5格的一抗孵育盒（4毫升即可）。4度过夜，一般是12-18个小时，注意放置水平，最后用摇床。内参等蛋白丰富很高的如果孵久了可能出现条带连在一起的情况，这时可以缩短孵育时间或者降低一抗的浓度。 六、孵二抗显影 1、孵二抗 这步要注意的是建议用5%BSA或者脱脂奶粉溶解二抗，这样背景会干净许多。也要注意膜的蛋白面要充分接触二抗溶液，我一般一条膜一个槽地孵。 2、显影 这一步有个细节可能有些同学没注意到，就是ECL发光液要与HRP反应一分钟后显影效果才会更好。 今天先讲这么多，如果想讨论更多细节问题，欢迎在评论区留言！也望得到大神指正！最后祝大家实验顺利！ |
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