【原】基因敲入技术实验原理及流程

基因敲入（gene knock in）是利用基因同源重组，将外源有功能基因（基因组原先不存在、或已失活的基因），转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。 

基因敲入有两种，一种是原位敲入,即在原基因敲除的位点插入新基因,它是基因敲除的逆过程；另一种是定点敲入,即无论敲除基因的位点在哪里,敲入的基因是在特定启动子下，以转移载体的形式转座进去,所以插入的位点是一定的。

  CRISPR-Cas9基因敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。

   同源性定向修复（HDR）途径，对比NHEJ修复途径，同源性定向修（HDR）途径是更为精确的修复机制。 这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。 在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点（图4）。这种修复方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

图1基因敲入原理图

基因敲入实验流程

    1 .设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

    2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

    3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

    4 .嘌呤筛选，检测荧光

    5 .PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

基因敲入实验步骤

    1. 设计sgRNA及修复DNA模版

针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。设计DNA修复模版，两侧同源臂，其两侧各有600bp的同源臂。

    2 .构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒

将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制备pCas-Guide-AAVS1（图2）。

将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体（图2）。

 图2 sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模版质粒

    3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

    用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。

    4. 嘌呤筛选，检测荧光

    嘌呤筛选3-4周

      3-4周后，> 95％的HEK293细胞表达RFP（图3）。

图3 荧光检测图片  A转染筛选后明场图片   B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞

     5. PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

    为了证实在基因组DNA中敲入RFP，设计引物对，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因内的引物2。

1.1kb的PCR产物表明在AAVS1位点敲入成功; 没有PCR扩增指示敲入不成功（图4）。

图4  PCR产物检测，在对照细胞（'WT细胞'）中没有看到PCR扩增。