小V常常接到科研小清新们的咨询，大家都在苦恼qPCR实验无从下手，或者好不容易做出了结果，又无法判断结果是否真实有效……
其实，解决问题的关键就是一个完美的实验设计!
来来，敲黑板，制作一个完美的实验设计要注意以下几点：
确定实验目标并了解该实验的重要关注点
比如：基因表达谱分析中需要重点关注RNA 质量、逆转录效率、qPCR效率、定量方法及内参基因的选择；而等位基因分型中引物和探针的设计是确保实验成功的关键。
确定扩增产物片段的大小、GC 含量和位置
a.PCR产物大小：一般为80–200 bp，越短的扩增片段受模板完整性差异的影响越小。如果核酸样本出现轻微降解，而靶序列较长，则上游和下游引物在同样的DNA 片段中寻找其互补序列的难度将更大；
b.GC含量：片段应选中等(50%) GC 含量且无明显GC 延伸段的区域
c.位置：对于cDNA 扩增，最好使扩增片段位于转录本的3’端附近。如果RNA 二级结构阻止了某些转录本的全长cDNA 合成，则这些扩增片段受影响的可能性更小。
基因组DNA残留处理
传统的有效规避基因组DNA 污染的方法是设计跨内含子-外显子引物，此方法不但较为复杂而且存在被假基因、可变剪切体污染的风险。那么，从源头上控制基因组DNA污染的方法成为热点，比如Vazyme 逆转录试剂（如图），只需要加入gDNA wiper后42 ℃ 2 min 即可在逆转录反应前轻松消除基因组DNA，得到无基因组污染的cDNA。
引物的特异性、二聚体形成和自折叠
引物除了需要在NCBI Blast验证特异性之外，还需关注引物二聚体的形成。常见的有正向和反向引物的相互作用，但也可能存在正向引物之间或反向引物之间的退火或者单个引物自身的折叠。
使用引物设计软件可预测以上情况的发生。此外，小V为大家推荐个免费的生物信息学工具—AutoDimer，可用来预测引物形成二聚体的风险。工具虽能预测风险，但预实验的验证是必需的。
RNA的质量
a.完整性检测：推荐跑胶或Agilent Bioanalyzer 仪器上评估RNA 的完整性；
b.杂质污染检测：测定A260/A280，A260/A230，确保比值在1.8 和2.0 之间。A260/A280比值低于1.8 表示存在蛋白质污染，会降低反应效率。A260/A230比值有助于评估硫氰酸胍和酚等的残留，它们同样会抑制酶反应。
对照设置
实时荧光定量PCR 所有实验应包括无模板对照(NTC)，qRT-PCR 反应还应包括无逆转录酶(NRT对照)。
NTC对照品：包含除DNA 或cDNA 样本外的所有反应组分。可判断由于引物二聚体或PCR 反应产物引起的污染。
NTC对照品：包含除逆转录酶外的所有反应组分（例下图，Vazyme货号R223）。可判断是否存在基因组DNA污染。
采用标准曲线评估效率、灵敏度
标准曲线是评估反应效率的最佳方法：通过构建连续稀释的样本核酸，进行实时荧光定量PCR，生成标准曲线。然后以起始核酸拷贝数对数值为X 轴，以Ct 为Y 轴，绘制曲线。曲线的斜率与反应效率之间存在下列关系，效率在90% 至110% 之间认为检测有效。
E（扩增效率）=10^(-1/曲线斜率）-1
标准曲线确定了实时荧光定量PCR 反应可测量的起始模板量范围，而稀释度最高的样本决定了反应的灵敏度。
简而言之，试验设计，只要不忘设计对照组（NTC，NRT），并注意预实验的设置，就一定能够得到可具分析的有效数据。
