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今天给大家带来《qRT-PCR》之---如何提取细胞RNA？ 一、基本原则 避免RNA酶污染，全程戴口罩和无菌乳胶手套（汗液和唾液中含有大量RNA酶) 二、主要试剂及仪器 Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇、DEPC水（或ddH2O) 三、操作步骤（全程戴口罩和手套） 1、Trizol处理。将细胞培养基吸出后，用预冷PBS洗涤3次，加入1ml Trizol（100mm培养皿），室温裂解1-2min，用移液枪均匀吹下细胞并置于无菌1.5ml EP管，上下轻柔颠倒数次，室温静置5min。 2、加入1/5体积氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4度，12000rmp，离心20min。（离心机提前预冷至4度） 3、将水相转移至新EP 管（缓吸、宁缺毋滥），加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，室温静置10min，4度，12000rmp，离心15min。 4、用真空泵或移液枪小心吸取上清液，加入预冷75%乙醇（无水乙醇配置），4度，12000rmp，离心10min。 5、弃上清液，EP管倒扣，空气干燥5~10min。 6、10~100ul DEPC水（或ddH2O)溶解。 7、NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，读取OD260/OD280比值。若比值在1.8~2.0之间，可进行下一步逆转录反应，若低于1.8，可能存在蛋白污染。 8、若暂时不逆转录，RNA置于-80度冰箱保存。 感谢您的关注，祝您科研顺利！ |
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