【原】单细胞测序中小鼠肝脏组织细胞悬液制备流程

背景介绍

肝脏，是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面充分扮演着去氧化，储存肝糖，分泌性蛋白质的合成等。肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。

肝脏的主要连接成分主要是结缔组织，因此我们选择使用胰蛋白酶对肝脏进行第一轮解离，枯草芽孢杆菌蛋白酶可水解天然和变性蛋白，并且在碱性条件下具有活性。我们使用其对肝脏组织进行进一步解离。

为了保存小鼠肝脏完整的基因表达谱，我们将成年小鼠肝脏置于冰上进行解离。小鼠肝脏第一层由0.25%胰蛋白酶在4℃下离解离10min，第二层解离由添加地衣芽孢杆菌酶，胶原酶及DNase I 组成的混合酶。解离产率为5000cells/mg，存活率大于等于93%（以AO/PI计数为标准）。

一. 实验试剂及耗材

表1. 小鼠肝脏组织解离部分试剂耗材参考表

名称	厂家	货号
1×DPBS	Thermo·Fisher	14190
胰蛋白酶	Thermo·Fisher	15400054
牛血清白蛋白	无要求	无要求
EDTA	final	A8806
地衣芽孢杆菌酶	Sigma	P5380
4 型胶原酶	Worthington	无要求
脱氧核糖核酸酶	无要求	无要求
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
移液管和枪头	无要求	无要求
离心管	无要求	无要求
培养皿	无要求	无要求
冰袋	无要求	无要求
血细胞计数仪	无要求	无要求
离心机	水平离心机	无要求

二. 实验步骤

1. 在预冷的组织保存液中保存及运输组织，配制酶解离液，置于冰上待用，离心机调整至 4℃ 预冷；
2. 将放有你1/2 体积 DPBS 的培养皿置于冰上，使用无菌的剪刀及镊子剪切组织直至糊状；
3. 使用 DPBS 对剪切的组织进行过筛清洗；
4. 离心管中每30 mg肝组织中加入1 mL 胰酶 ，通过摇晃离心管重新悬浮组织颗粒，在室温下静置10 min。
5. 在离心管中加入5mL预冷的DPBS，稀释胰蛋白酶混合液，终止消化。
6. 在离心机中使用250g 4℃ 离心5min后，除去上清液；
7. 在离心机中加入4mL预冷的DPBS重悬细胞核组织，在冰上沉淀40s 大组织块沉降（此时释放的细胞留在上清液中）。
8. 将收集的上清液（含细胞）通过40µM细胞筛过滤，去除结团细胞及组织块；
9. 过滤后的细胞悬液通过4℃ 300g离心 5min 收集；后再使用0.5 mL的PBS （含1% BSA）重悬细胞，置于冰上保存。
10. 将步骤 7 中剩余的组织块加入组织解离酶（5mg/mL，胶原酶 IV 0.8mg/ml，DNase I  0.5mg/ml），置于37℃ 的摇床上 80rpm/min进行解离；
11. 消化 8-12min之后，加入两倍体积的 DPBS稀释终止消化，取出离心管，涡旋仪上，轻微涡旋2-3次（2S/次）。
12. 将终止消化后的酶及细胞混合物分别通过 70μm和40μm的细胞筛，下清液离心收集细胞。
13. 在4°C下旋转300 g 离心5 min，除去上清液，使用DPBS（含1% BSA）重悬细胞，置于冰上备用。
14. 将步骤9 ，步骤12中的细胞4°C下旋转300 g 离心5 min离心收集，弃上清；加入1-4mL红细胞裂液，置于冰上3-5min裂红。
15. 裂红结束后加入等体积的DPBS, 在4°C下, 300 g 离心5 min 收集细胞，弃除裂红液；
16. 使用0.5% BSA的DPBS重悬细胞，离心收集，弃上清，而后用含有0.5% BSA的DPBS重悬细胞，用AO/PI染料染色计数。

三. 结果及注意

注意：肝脏组织中杂质及碎片较多，且肝细胞容易破裂；所以解离过程中要注意根据实际情况适当下调。富集细胞时的离心力，为达到彻底清洗碎片和杂质的目的，在解离过程中使用的解离酶浓度和强度不宜过高，获取的单细胞悬液如果用于单细胞测序，则需要在获取细胞悬液之后尽快进入下游建库，避免因细胞破裂引入RNA 污染问题，从而影响测序数据质量。