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物理化学研究所 庆应义塾大学尖端生命科学研究所 从细胞图像中解读肠道菌群的状态 - -开发利用深层学习的新分析方法- 由理化学研究所(理研)生命机能科学研究中心多层次生命动态研究小组组长、庆应义塾大学尖端生命科学研究所教授福田真嗣等人组成的共同研究小组，开发了根据粪便的显微镜图像推测“肠内细菌丛[1]”状态的新方法。 由于本研究成果可以应用于调查肠内细菌丛的状态，预测并控制其行为的技术，期待为健康维持和疾病的诊断·防治法的开发做出贡献。 联合研究小组开发了从反映健康状态、肠内细菌丛状态不同的老鼠身上提取粪便，将其显微镜图像作为输入数据提供给深层学习[2]，从而根据粪便图像推测肠内细菌丛状态的方法。 并且，通过粪便图像成功地预测了由放大器序列分析[3]得到的肠内细菌丛的组成比。 通过这种方法，可以简便且廉价地推测肠内细菌丛的状态。 本研究刊登在在线科学杂志《iScience》( 11月22日)上。
作为调查肠内存在多少种细菌的方法，广泛使用的是“功放序列分析”，即利用PCR法[4]扩增肠内细菌基因组的特定区域，调查其中所含序列的种类及其数量。 但是，由于该方法在分析中使用新一代可编程控制器[5]，因此需要比较复杂的实验操作、长的分析时间、高成本。 因此，例如调查个人肠道菌群的每天变化等，在迅速分析很多样本的情况下，未必是合适的方法。 另一方面，机器学习人工智能技术的发展使从图像数据中解读各种信息成为可能。 例如，即使是人眼看起来一样的细胞图像，如果是经过适当训练的人工智能的话，也能够区别各个细胞处于什么样的状态。 实际上在医疗领域的应用也很盛行，通过让深层学习等人工智能学习病理图像，可以高精度地检测各种癌症组织。 近年来，利用这种机器学习人工智能技术对肠道菌群的分析备受期待。 研究方法和成果 本研究开发了利用深层学习，根据粪便的显微镜图像推测肠内细菌丛状态的新方法。 联合研究小组为了显示其有效性，准备了实施了改变肠内细菌丛状态处理的老鼠，并采集了其粪便。 具体来说，我们给5只小鼠注射了诱发结肠炎的药物葡聚糖硫酸钠( DSS ) [6]，在结肠炎发展的过程( 9天)和停止注射DSS从结肠炎中恢复的过程( 7天)中采集了粪便。 另外，作为其他处理，给予高脂肪食物5周，从诱导肥胖的5只老鼠身上采集了粪便。 通过革兰氏染色[7]将这些粪便样本中含有的肠道细菌可视化，用低倍率的显微镜获取图像(图1 )。
图1小鼠粪便的显微镜图像示例 给药诱发结肠炎的葡聚糖硫酸钠( DSS )前( a )和给药DSS后第9天( b )的小鼠粪便进行革兰氏染色，获得了显微镜图像。 尺度为200微米。 图的图像具有1360×1024像素的尺寸，但是将从这里切出256×256像素的低分辨率图像作为输入数据使用。 从数百张图像中学习了各个状态。 通过将这样得到的粪便图像作为输入数据提供给深层学习，让其学习，验证了能否推测小鼠的肠内细菌丛状态。 让结肠炎发病恢复小鼠和肥胖小鼠各5只中的4只图像作为教师数据[8]进行学习，以未用于学习的剩余1只图像作为输入数据，推测处于什么样的肠内细菌丛状态，结果推测大致正确的状态成功(图2 ) 虽然有一些“错误”，但是其中很多是“相近状态的错误”，比如大肠炎发病恢复小鼠的“服用DSS后第7天”的状态和“服用DDS后第8天”的状态有所不同。 因此，这一结果显示，可以根据粪便图像推测出肠内细菌丛的连续变化。  图2粪便影像预测肠道菌群类别的实例 HF0、HF5分别表示摄取高脂肪食物前、摄取开始5周后的数据，DSS0~9的数字表示服用DSS后的天数，ADSS1~7表示停止服用DSS后的天数。 用数值和颜色的浓度来表示预测的正确性，对角线附近呈深色表示能够进行正确的预测。 例如，可以看出，正确判定DSS7粪便图像为DSS7类别的比例为65%，但错误判定大多是类别相差1天的DSS6和DSS8等“相近状态的错误”。 今后的期待 本研究通过利用深层学习技术，开发了根据粪便的显微镜图像推测肠内细菌丛状态的方法。 与广泛使用的功放序列分析相比，此次开发的方法可以低成本获取粪便图像的输入数据，因此可以简便且廉价地分析肠内细菌丛的状态。 通过将此次开发的这项技术应用于医疗，有可能在病理检查室根据粪便图像诊断出例如以肠内细菌丛紊乱为原因的大肠癌和结肠炎。 另外，如果在厕所设置简单的光学系统、数码相机、以及适当的流路，能够自动获取粪便的显微镜图像，则有可能追踪个人肠道菌群每天的变化情况，预测疾病的发病。 由于基于此次开发的粪便图像和人工智能的分析可以推广到预测和控制肠内细菌丛这一复杂的生态系统的技术，因此期待着为健康维持和医疗做出巨大的贡献。 补充说明 1 .肠道细菌丛 由生活在包括人类在内的动物肠内的各种各样的肠内细菌构成的生态系统。 肠内细菌承担着构建宿主免疫系统、提供营养素、辅助消化等作用。 近年的研究报告指出，肠道菌群失衡将导致各种疾病，作为疾病防治的重要目标受到关注。 2 .深层学习 是使用多层神经网络的机器学习方法的一种。 用非线性函数对数据之间不言自明的关系进行模型化，通过学习输入输出数据的关系，从而实现分类和预测等任务。 本研究使用的是深层学习之一的卷积神经网络( CNN )，广泛应用于图像的分类。 3 .放大器顺序分析 利用PCR法扩增DNA中特定的基因组区域，用下一代可编程控制器进行分析的方法。 在肠道菌群研究领域，通过放大和分析肠道菌群基因组的16S rRNA基因，分析样品中所含细菌的种类和比例。 4.PCR法 放大DNA特定部分的方法。 首先，将扩增对象的DNA、DNA合成酶( DNA聚合酶)、大量称为引物的寡核苷酸混合，制作反应液。 加热反应液后，双链DNA发生变性，变成单链DNA。 接着急速冷却的话，DNA聚合酶以结合(退火)的引物的3 '端为起点进行作用，合成与单链部分互补的双链DNA。 这样就形成了两倍量的DNA。 再次加热，从DNA变性开始重复。 这样，PCR法利用DNA链长不同引起的变性和退火的不同，仅通过温度的上下反复进行DNA合成，将DNA放大至2倍、4倍、8倍、16倍…。 PCR是Polymerase Chain Reaction的缩写。 5 .新一代可编程控制器 与利用桑格法的荧光毛细管可编程控制器“第一代可编程控制器”对比使用的术语。 根据机型不同，一次可以决定1，000万~100亿个DNA的序列。 以前，决定人类的基因组序列需要14年左右，但使用新一代可编程控制器只需要几天就可以决定。 6 .葡聚糖硫酸钠( DSS ) 通过添加到饮用水中，具有阻碍肠上皮细胞作用的化合物。 用于肠炎模型小鼠的制作。 ds是Dextran Sodium Sulfate的缩写。 7 .革兰氏染色 根据细胞壁结构的不同，将细菌分开染色的染色法。 将细菌用紫色和红色色素染色，染成紫色的为革兰氏阳性，未染色为紫色的为革兰氏阴性。 大肠杆菌呈革兰氏阴性。 8 .教师数据 在机器学习中，用于学习的输入输出的数据集。 针对给定教师数据的输入，调整模型以进行对应的输出。 之后，评价对未用于学习的输入数据是否进行了适当的输出。 在这次的研究中，将一部分小鼠的粪便图像数据和对应的肠道菌群状态(例如服用DSS后4天)的配对用作教师数据，在用其进行神经网络的学习后，输入未用于学习的小鼠的粪便图像数据时没有适当的输出 9 .奥托 分类单位，用于将具有任意阈值以上的相似度的DNA序列彼此进行聚类，为了方便将其作为一个序列来处理。 在肠道菌群研究领域中，将97%以上相似度的序列作为来自相同菌种的序列来处理，大致相当于属级的分类群。 OTU是operational taxonomic单元的缩写。 联合研究小组 理化研究所生命机能科学研究中心多层次生命动态研究小组 队长古泽力 技术人员ⅰ田边久美 庆应义塾大学尖端生命科学研究所 特任教授福田真嗣 研究员石井千晴 加贺田纪子 教授冨田胜 研究支援 本研究包括:理化研究所运营费补助金(生命机能科学研究、组织横断合作项目“生命科学的横断努力对解决超高龄社会课题的贡献”)、是在科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业总结实施型研究( ERATO )“深津共生进化机构项目(研究总结:深津武马)”等的支援下进行的。 原论文信息 Chikara Furusawa, Kumi Tanabe, Chiharu Ishii, Noriko Kagata, Masaru Tomita, Shinji Fukuda, "Decoding gut microbiota by imaging analysis of fecal samples", iScience, 10.1016/j.isci.2021.103481 发表者 物理化学研究所 生命功能科学研究中心多层次生命动态研究小组 队伍队长古泽力
古澤 力 庆应义塾大学尖端生命科学研究所 特任教授福田真嗣
福田 真嗣 图3从粪便图像预测放大器序列分析结果的示例 |
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