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其实转录组现在很普及了，一个样品的测序价格也非常低。转录组的作用几乎如同于PCR一样常见，在很多文章中只是一个验证的作用，很少有文章单纯靠转录出发做一个研究，除非你有非常好的新点子。 对于转录组有很多解说，本来不太想说，只想说一下作图，我以为大家都是懂得的，但是在与自己身边的人相处的过程中，我发现其实不太做生信组学的人确实比较懵，就如同我不懂一些分子学实验一样。所以我觉得有必要从头说一下转录组的一些基础知识，仅仅是普及，不涉及深入的原理。我们的目标是是让大家知道什么是转录组（毕竟有很多小白还没有入门），应该怎么去看？怎么去做？怎么挖掘？用于自己的具体研究！ 1、为什么送转录组测序 组学测序是探究未知的一个好手段。转录组不仅仅是基因（mRNA），还包括小RNA（miRNA，lncRNA等），这些转录组的分析方法是一样的。一般转录组会有对照组和实验组（对照组应该是必须的），然后测序看基因的变化去推测机制，说白了，转录组的目的就是筛选差异表达的基因！ 转录组测序送样需要重复，这也是必须的，一般至少三个重复。组内样品的一致性对于结果也是比较重要的。看样组间、组内差异看PCA或者相关分析！公司的测序结果文件中包含这部分内容，可以进行判断！ 2、测序文件应该看什么 下图是一般测序从公司拿到的结果。 在这么多文件中，对于我们“普通人”只是利用转录组的结果，我们关注的只有基因表达和差异基因这两个文件。基因表达文件是为了做热图，差异基因文件是为了做火山图或者寻找差异基因做富集分析。公司的富集结果我认为不用看了，因为自己分析数据关注的差异基因筛选阈值不一样，富集数据库选择不一样，重新分析即可。 一般无特殊要求，使用公司提供的差异基因文件就可以进行后续分析了，但是如果是数据挖掘用别人的数据，则需要重新分析，这我们在后续会讲到。 3、一些概念例如read count、FPKM等 Read count，RPKM, FPKM, RPM, TPM这些次我想很多人都听过见过，但是一直也没搞明白这是什么，这里我们简单说一下。Read Count: The number of reads mapped to this gene. 这是高通量测序的文件，每个样本中每个基因的reads都会统计然后用于差异基因分析，用read count分析差异基因只能用DESeq2和edgR这两个R包，这两个R包会对read矩阵进行标准化。RPKM：(每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)，主要用来对单端测序（single-end RNA-seq）进行定量的方法。FPKM：(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)，主要是针对pair-end测序表达量进行计算。FPKM和RPKM可以视为表达量。不能用于差异基因分析！ RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads). 不能用于差异基因分析！TPM：(每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)，优化的RPKM计算方法，可以用于同一物种不同组织的比较。 这些概念的比较统计如下图： 为什么要整这么多概念，主要是因为目前的测序技术，我们不能直接看到一个基因表达了多少，而是将RNA打断去匹配，这就涉及到测序深度和基因长度了，为了解决这个矛盾，所以需要用合适的方法去计算基因的表达。最终的目的还是为了让数据可靠有意义！！！ 4、转录组测序分析一般流程？ 一般利用转录组的流程是：降维分析---差异基因分析---富集分析---通路富集，最终可能是为了找到某一个或者一系列重要的基因，找到通路，做实验验证或者分子生物学继续挖掘机制。 一些常见的关于转录组的图： PCA：降维用的，如果两组样本差异大，那么在PCA图上会分的很开。 相关分析：看组内组间的差异。 热图：表示差异基因表达的一种手段。 火山图：也是表示差异基因的一种手段，同时体现了差异基因P值和FC。 GO、KEGG、GSEA、GSVA等：差异基因功能和参与通路的分析。可视化方式很多！ 我们看看最新的2021发表在NC上的转录组文章，看它的图1，我想就能基本知道转录组数据拿到手应该做些什么，哪些是必须的，哪些是按照实际情况按需挖掘的！ 我想简单了解了就会胸有成竹，知道怎么去利用它即可。至于深入的原理，如果不是专业做生信分析的，无需了解。 |
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