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摘 要：目的 利用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用（ultra performance liquid chromatography quadrupole-time-of- flighthybrid mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）分析三七的主要化学成分，运用网络药理学研究三七抗炎的多成分、多靶标、多途径作用机制。方法 通过UPLC-Q-TOF-MS分析三七的主要化学成分，使用DAVID数据库进行基因本体论（GeneOntology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genesand Genomes，KEGG）通路分析，并运用Cytoscape3.6.1软件绘制网络互作图，ImageGP工具绘制GO气泡图。结果 研究得到人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、月桂酸单甘油酯（monolaurin）等22个关键抗炎作用的活性成分和表皮生长因子受体（EGFR）、信号传导蛋白和转录激活物3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）等31个关键靶点。GO、KEGG通路富集分析发现，三七可能主要通过人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、月桂酸单甘油酯、β-胡萝卜苷（β-daucosterol）和人参环氧炔醇（panaxydol）等活性成分，作用于EGFR、STAT3、MAPK14、白介素-2（IL-2）等靶点，调节癌症信号通路（Pathways in cancer）、细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、突触细胞黏附分子（CAMs）等信号通路发挥抗炎作用。结论 三七抗炎体现了多成分、多靶点、多途径的特点，为进一步开展三七抗炎作用药效物质基础和作用机制研究提供了新的思路和方法。 炎症是机体对各种炎症因子所致的损伤而发生的一种以防御为主的局部组织反应，包括局部组织的变质、变性、充血、坏死、体液和细胞的渗出与组织和细胞的增生，故局部以红肿热痛为主要表现，全身反应多见发热、白细胞增多，单核巨噬细胞增多，以及心脏、肝、肾的变性、坏死和功能障碍[1]。炎症的持续存在对机体是有害的，在很多重大疾病的发生、发展过程中起着重要作用。市面上已出现多种相关药物如非甾体类抗炎药和甾体类抗炎药，但长期大量使用会引发多种脏器的不良反应，因此在使用过程中有一定的局限性。中药在治疗炎症方面具有疗效较好、毒副作用小等优点，成为研究新热点[2]。 三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen的块根，具有止血、散瘀、定痛的功效。常用于治咳血、吐血、衄血、便血、外伤出血、跌打瘀痛、崩漏、产后血瘀腹痛、冠心病心绞痛等，是典型的中药材大品种[3]。目前，含三七中成药品种共计455个，产品数量总计超过2000个。2017年，中华中医药学会发布了《中药大品种科技竞争力报告（2017版）》，我国中药品种批准文号近六万个，而入围的中药大品种548个，其中有48个产品处方组成含三七[4]，高达8.7%。按照临床治疗领域对48个含三七的中成药大品种进行分析，这些产品的临床主要治疗领域较为集中分布在心血管病领域、骨骼肌肉用药和妇科用药3个领域，上述疾病的发生、发展均与炎症密切相关，但三七抗炎的具体作用机制尚不明确。 中药具有多成分、多靶点作用特点，导致研究其治病机制时存在困难。网络药理学是以系统生物学为基础，利用生物网络数据库、各种生物网络构建方法和生物网络分析技术，通过网络构建工具，系统阐述“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂网络关系的一门交叉学科[5]。中医药研究的整体观与网络药理学的整体性相契合，将网络药理学的方法应用在中医药研究中已成为趋势。本研究拟将UPLC-Q- TOF-MS与网络药理学方法联合，预测三七抗炎活性成分、潜在作用靶点及作用机制，为三七临床应用和基础研究提供新的思路。 1 仪器与材料 Acquity超高效液相色谱分析系统，Q-Tof micro高分辨四级杆与飞行时间串联质谱仪（配有lock-spray接口），美国Waters公司；Acquity UPLCTM BEH C18反相色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），美国Waters公司；BP210D分析天平，德国Sartorius公司；DL-360A超声波清洗器（50 Hz，400 W），上海之信仪器有限公司；FRESCO17低温高速离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；Masslynx V4.1数据软件处理系统，美国Waters公司。 甲醇（HPLC级），德国Merck公司；乙腈（UPLC级），德国Merck公司；Lockmass脑啡肽（质量分数≥95%），美国Sigma公司，批号L9133-50MG；超纯水（优级），屈臣氏；甲酸（色谱纯），德国CNW科技公司；甲酸铵，Aladdin公司，批号41470。 2 方法 2.1 三七化学成分分析 三七于云南文山采集，经广东药科大学滕希峰副教授鉴定为五加科人参属植物三年生三七P. notoginseng (Burk.) F. H. Chen。取三七10 g，粉碎，过5号筛，得药材粉末。精密称取三七粉末0.3 g，置锥形瓶中，加入60%甲醇1.5 ml，超声1 h，吸取粗提液至离心管中，离心5 min（转速12 000r/min、温度20 ℃）。随后取适量上清液至进样瓶中，4 ℃保存，备用。 色谱条件：色谱系统为Waters Acquity UPLC/Q- TOF Micro MS；色谱柱为Acquity UPLC BEH C18反相柱；柱温40 ℃；进样量10 μL；体积流量0.3 mL/min；二元梯度洗脱，流动相为0.2 mol/L甲酸水溶液（含10 mmol/L甲酸铵）-乙腈；梯度洗脱条件：0～1.0 min，2%乙腈；1.0～2.0 min，2%～10%乙腈；2.0～5.1 min，10%～25%乙腈；5.1～6.1 min，25%～32%乙腈；6.1～8.1 min，32%～38%乙腈；8.1～8.6 min，38%乙腈；8.6～9.1 min，38%～50%乙腈；9.1～9.6 min，50%～55%乙腈；9.6～12.5 min，55%乙腈；12.5～14.0 min，55%～70%乙腈；14.0～16.1 min，70%～100%乙腈；16.1～18.5 min，100%乙腈。 质谱条件：电喷雾离子源正离子模式（ESI+）：毛细管电压（capillary）：2 800 V，锥孔电压（sample cone）：20 V，离子源温（sourcetemperature）100 ℃，脱溶剂温度（desolvation temperature）350 ℃，脱溶剂N2体积流量为500 L/h，锥孔反吹N2体积流量为50 L/h，脱溶剂气为N2，碰撞气体为Ar；采用Lock mass通路对实验数据采集进行实时校正，Lock mass对照品溶液为脑啡肽（10 μg/mL），校正切换频率为10次/s，扫描范围为m/z 50～1 500。正离子模式下的Lock mass分别为m/z 556.277 1[6]。 根据UPLC-TOF-MS获得相应色谱峰对应化合物的精确相对分子质量，得到化合物的分子式，并通过文献进行对比，对化合物进行定性分析，筛选得到三七化学成分，然后在Pubchem数据库中查询Canonical SMILES号。 2.2 三七作用靶点预测 通过查询Swiss Target Prediction[7]数据库，将获得的Canonical SMILES号上传，点击Predict targets进行分析，输出化合物靶点信息[8]。将得到的化合物靶点信息导入Uniport[9]数据库中，选择物种为“Homo Sapiens”，进行批量标准化，将审核过的基因下载。将审核过的三七主要活性成分的靶点与CTD[10]、Genecards[11]数据库中查询到的与抗炎（anti-inflammatory）有关的靶点进行对比分析，筛选出三七主要活性成分抗炎的潜在靶点。 2.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建（PPI） 将所得三七抗炎的潜在靶点导入String[12]数据库，选择“Multiple protein”，物种选择为“人源”，得到蛋白相互作用关系，导出相关数据并导入Cytoscape软件，根据score值和degree值设定node和edge的颜色和大小粗细，最后得到蛋白相互作用网络图。 2.4 GO功能与模块分析、KEGG富集通路分析 将筛选出的三七抗炎的潜在靶点输入DAVID（the databasefor annotation，visualizationand integrated discovery）数据库进行KEGG（Kyotoencyclopedia of genes and genomes）通路分析[13]和基因本体（gene ontology，GO）生物学过程分析，以P＜0.05为筛选条件，得到相关分析结果。将DAVID数据库得到的GO富集分析结果导入image GP数据库，得到GO分析结果。运用“MCODE”插件对所有具有统计学意义的GO生物过程聚类分析。 2.5 三七提取物活性成分-靶点-通路网络构建 采用Cytoscape 3.6.1软件中的Merge功能，构建三七提取物活性成分-靶点-通路网络图。其中，节点代表活性成分、靶点和信号通路，边用来连接活性成分、靶点和信号通路。 3 结果 3.1 三七主要化学成分 通过UPLC-Q-TOF-MS分析，得到三七总离子流图，见图1。显示主要有38个色谱峰，通过质谱提供的化合物相对分子质量信息，并与已知文献进行对比，总共得到个22化合物，主要包括月桂酸、monolaurin、β-daucosterol、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1等。具体成分见表1。 3.2 活性成分靶点预测 按照方法“2.2”项中的方案，将审核过的725个靶点下载，再应用GeneCards数据库搜索与抗炎（anti-inflammatory）相关的靶点有11 564个，CTD数据库搜索相关靶点有43 541个，2个数据库重复靶点有10 154个。与上述725个靶点比对分析后，得到31个三七抗炎的潜在作用靶点。主要包括表皮生长因子受体（EGFR）、信号传导蛋白和转录激活物3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）、白介素-2（IL-2）等。详见表2。 3.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建 按照方法“2.3”项中的方案，最后得到蛋白相互作用网络图，见图2。由图2可知，该网络图中包含有31个靶点、225条边，degree值越大，节点越大，而combined score值越大，边越粗，其中具有较大度值（degree值＞15）的蛋白质有IL6、TNF、IL2、ICAM1、CXCL8等。通过网络图，可以直观的发现化合物与靶点之间复杂的互作关系，进一步表征了三七通过多成分、多靶点的协同调控减缓炎症的作用特点。 3.4 靶点生物学功能注释 通过Image GP的GO Enrichment Plot插件对三七抗炎潜在靶点进行GO生物学功能分析，结果见图3。GO分析有3个分支，共富集到23条参与三七抗炎的生物学过程，主要包括炎症反应的调节、免疫系统发育、抗氧化活性、脂质结合、铁离子结合、血红素结合、细胞迁移的正调控、过氧化物酶活动等。这些靶点通过参与炎症反应的过程，减缓炎症的发生、发展。 3.5 潜在靶点GO生物过程模块分析子簇图 随着系统生物学研究的深入，发现生物分子并不以单体的形式进行工作，而通常是通过由相互作用的模块（module）组成的分子网络进行工作[14]。按照MCODE聚类分析算法将GO生物过程进行模块分析，筛选得到K-Core≥2的9个聚类模块（图4），依次是核酸分解代谢过程、脂质代谢过程、毛发循环过程、生物体之间的种间相互作用、离子稳态、多细胞生物繁殖、昼夜睡眠/觉醒周期过程、免疫系统过程、解剖结构形态发生等生物过程。 3.6 KEGG富集通路分析 将31个三七抗炎的潜在靶点输入DAVID进行KEGG通路富集分析。以P＜0.05为筛选条件，发现有20条通路被富集（图5）。主要包括免疫系统：TLRs、Chemokine signaling pathway、NLR、Leukocyte transendoth elial migration、Graft-versus- host disease，内分泌系统：Adipocytokine signaling pathway，信号转导：Jak-STAT signaling pathway，信号分子和相互作用：CAMs、Cytokine-cytokinereceptor interaction，癌症通路：Pathways in cancer等。上述通路中目前报道与炎症相关的主要有Pathways in cancer、TLRs、Chemokine signalingpathway、Adipocytokinesignaling pathway、Jak- STAT、NLR、CAMs。 3.7 三七活性成分-靶点-通路网络构建 按照方法“2.5”项中的方案构建三七活性成 分-靶点-通路网络，由图6可知该网络有73个节点，包括22种成分、31个靶点、20条通路和221条边，节点越大，说明度值越大，与其相连的节点数越多，其中人参皂苷Rg1、Rh1及monolaurin、β-daucosterol和panaxydol等度值较大，表明其是抗炎的重要活性成分。另外，靶点节点越大，靶点度越大，与其相连的成分越多，图中EGFR、STAT3、MAPK14、IL2等靶点节点较大，可能是三七发挥抗炎作用的重要靶点。其中Pathways in cancer、Cytokine-cytokine receptor interaction、CAMs、Graft-versus-hostdisease 4条通路节点较大，可能是三七发挥抗炎作用的重要通路。 4 讨论 以“三七”为关键词，通过CNKI检索2009—2019年发表的文献共计有2 651篇，可见三七是研究热点。既往有关三七药效作用及机制的研究多集中在心脑血管疾病领域，如冠心病、动脉粥样硬化、缺血性脑损伤等，未见有探讨三七主要活性成分抗炎作用网络药理学研究的报道。炎症，是多细胞生物的一种基本的“生命保险”机制，但慢性炎症反应通常是有害的[15]。因此，研究三七主要活性成分抗炎作用机制，对进一步扩大三七应用范围具有重要意义。 4.1 三七抗炎活性成分 以往三七抗炎作用相关的研究多集中在三七总皂苷上，本实验通过UPLC-Q-TOF-MS分析显示三七主要成分有22种，其中人参皂苷Rg1、Rh1及月桂酸单甘油酯（monolaurin）、β-胡萝卜苷（β-daucosterol）和人参环氧炔醇（panaxydol）等度值较大，可能是三七抗炎的主要成分。 人参皂苷Rg1为三七总皂苷的主要成分，任周新等[16]研究发现，三七总皂苷（PNS）通过抑制缺血脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1和IL-8的含量，抑制中性粒细胞的趋化运动，从而减少其在缺血脑组织的浸润和活化，减轻脑组织损伤。姜辉等[17]在肝纤维化小鼠研究中发现，PNS能降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1、TGF-β的表达，升高抑炎因子IL-10的表达从而缓解炎症的发展。Choi等[18]研究发现，人参皂苷Rh1抑制炎症的作用与减少MAPK的磷酸化和激活以及PKB/Akt的激活有关。Zheng等[19]研究人参皂苷Rh1（20 mg/kg）对唑酮诱导的小鼠皮肤炎症的作用，结果表明人参皂苷Rh1能明显抑制血清总白细胞介-E（IL-E）的水平，减轻炎症特应性皮炎症状。张春晶等[20]利用卵蛋白诱导小鼠哮喘模型，通过检测小鼠血清中免疫球蛋白IgE和IgG的变化，以及支气管肺泡冲洗液中的IL-4、IL-5和IFN-γ的变化，证实了人参皂苷Rh1对哮喘小鼠具有抑制炎症因子表达、调节免疫反应和改善肺组织病理变化的作用。赵敏洁[21]在月桂酸单甘油酯对高脂膳食饲喂小鼠脂代谢紊乱的调节作用的研究中，表明月桂酸单甘油酯能显著降低血清TNF-α和IL-6水平，缓解高脂膳食诱发的低度系统炎症。 可见现有文献报道三七抗炎作用以人参皂苷Rg1、Rh1和monolaurin较为多见，β-daucosterol、panaxydol等的较少，其抗炎的药效和作用机制，同样值得进一步研究。 4.2 三七抗炎潜在作用靶点 由靶点蛋白相互作用网络图可知，EGFR、STAT3、MAPK14、IL-2靶点节点较大，与其相连的成分较多，可能成为三七抗炎的主要潜在靶点。 研究发现白头翁汤能降低结肠组织的EGFR水平，并在干预早期控制小鼠肠道炎症发展，可能是通过下调EGFR抑制PI3K-AKT信号通路的激活，促进细胞凋亡，从而避免了继发的炎症反应[22]。STAT3是炎症发展过程中的重要节点，可通过介导炎症介质的细胞外信号调控肿瘤细胞、免疫细胞等的生物学行为，是慢性炎症促进肿瘤发生及肿瘤相关性炎症形成过程中不可或缺的关键性分子[23]。MAPK14即p38α是p38丝裂原活化蛋白激（p38MAPK）家族成员之一。MAPK14作为MAPK家族中的重要成员之一，其表达异常可致机体生理功能紊乱，引发机体免疫功能失调，导致许多疾病的发生，与炎症反应密切相关。当机体受到不同的理化因素、炎性因子、脂多糖、紫外照射等刺激后，可通过活化MAPK14蛋白来激活p38MAPK通路，从而启动炎症级联反应[24]。IL-2是一种刺激细胞生长的因子，可以维持细胞的生存和抑制细胞凋亡，在机体免疫反应及细胞存活中扮演至关重要的角色。在免疫细胞中，IL-2与IL-2受体相结合激活Jak/STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路和MEK/ERK信号通路，与炎症的发生密切相关[25]。Dagenais-Lussier等[26]发现在HIV-1感染期间，持续的炎症与代谢活性的增强有关，代谢活性增强产物会通过IL2信号传导损害记忆性CD4＋ T-cells。 本研究发现人参皂苷Rg1、Rh1和月桂酸单甘油酯等药效成分可与EGFR、STAT3、MAPK14、IL2等多个靶点形成相互作用，上述靶点在炎症的发生、发展中具有重要作用，但目前关于三七作用于上述靶点的研究报道尚不丰富，因此，后期可针对上述靶点进一步开展相关研究，为拓展三七应用范围提供依据。 4.3 三七抗炎分子机制 通过通路分析，本研究发现三七抗炎作用与癌症信号通路（pathways in cancer）、细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor Interaction）、突触细胞黏附分子信号通路（cell adhesion molecules，CAMs）等密切相关。 4.3.1 癌症信号通路 癌症信号通路包含了与肿瘤形成15个信号转导通路特定标志物基因。其中NF-κB通路、Cox-2通路、STAT通路与炎症的发生发展密切相关。NF-κB在癌症方面是一把双刃剑。一方面，NF-κB的激活是免疫防御的一部分，免疫细胞和抗癌细胞具有强活性时，会伴随着NF-κB的完全活化，靶向作用并消除转化细胞[27]。另一方面，在许多类型的癌症中NF-κB基本都处于激活状态，并且可以发挥多种促肿瘤发生功能。炎症反应的生理应激使NF-κB活化，通常又导致抗凋亡基因的上调，从而提供细胞存活机制[28]。STAT3通路的过度活化能够诱导肿瘤的促炎微环境，与IL-11本身具有的抗炎作用相反，研究发现在IL-11受体基因缺失后，STAT3激活作用减弱，并抑制了肿瘤细胞的增殖[29]。研究表明STAT3的持续激活与乳腺癌、肺癌、宫颈癌等密切相关[30]。Cox-2与脂肪肉瘤[31]、肾癌[32]、胰腺癌[33]等肿瘤的发生发展密切相关。 结合成分-靶点-通路网络可见癌症信号通路主要参与靶点为EGFR、IL6和STAT3。其中人参皂苷Rg1、Rh1及月桂酸单甘油酯、β-胡萝卜苷和人参环氧炔醇为EGFR相关的主要活性成分。月桂酸单甘油酯是与IL6相关的主要活性成分；人参皂苷Rg1、Rh1和β-胡萝卜苷是与STAT3相关的主要活性成分。EGFR的激活可致使细胞内酪氨酸激酶磷酸化，从而启动一连串的细胞内信号途径，包括Ras-MAPK、PI3K-AKT和STAT信号传导途径[34]。这些信号传导途径在肿瘤细胞侵袭，转移和凋亡过程中起重要作用。STAT3是信号转导和转录活化因子家族的重要成员之一，因其可介导细胞的恶性转化和肿瘤的生成而被确认为癌基因[35-36]。STAT3作为EGFR的下游信号蛋白之一，EGFR激活后能促进STAT3磷酸化，进而促进肿瘤细胞生存。炎症因子IL-6通过活化STAT3信号通路，诱导SOCS3基因甲基化，进而导致STAT3通路失衡及持续活化[37]。本研究结果为三七抑制肿瘤发展过程中的慢性炎症提供了新思路。 4.3.2 细胞因子受体相互作用 细胞因子是一种可溶性多肽，能够广泛参加机体的生理病理状态，影响机体的多种生物效应。KEGG分析显示[13]，细胞因子受体相互作用差异基因主要涉及的信号通路出现在趋化因子家族和TNF家族中。 趋化因子属G蛋白偶联受体超家族成员，其主要作用是信号传递，广泛表达于内皮细胞、上皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中[38]。在炎症的发生过程中，血液中的淋巴细胞表面可表达不同类型的趋化因子和黏附因子受体，这些受体能够识别内皮细胞上表达的趋化因子和黏附因子蛋白，从而引起淋巴细胞构象改变，从而可穿过上皮细胞的单细胞层进入组织，并启动趋化因子信号梯度而发挥抗炎作用[39]。许多抑郁症患者的相应脑区都存在炎症反应, 而介导炎症反应的趋化因子在其中发挥重要作用。趋化因子与抑郁症涉及的神经可塑性、单胺类神经递质减少及神经内分泌系统密切相关[40]。 TNF作为一种重要的细胞因子，可诱导细胞内多种信号通路，包括凋亡、细胞存活、炎症、免疫等。被激活的TNF可与TNFR1，TNFR2结合，导致TNFR1或TNFR2的三聚体化。TNFR1信号可诱导许多基因的激活，主要受NF-κB途径和MAPK级联两种不同的途径控制；TNFR2信号通路激活NF-κB通路，包括PI3K依赖性NF-κB通路和JNK通路，与炎症的发生发展密切相关。结合成分-靶 点-通路网络可见细胞因子受体相互作用通路主要参与靶点是EGFR、IL6、IL2和TNF。其中IL6、IL2和TNF与NF-κB密切相关，是细胞因子受体相互作用中的重要调控靶点。目前，有关三七介导NF-κB的相关研究主要集中在心血管疾病领域，为下一步将三七应用范围拓展到抑郁症、溃疡性结肠炎、关节炎等疾病提供了线索。 4.4.3 CAMs CAMs是一类跨突触锚定的膜表面糖蛋白，在包括止血、免疫反应、炎症、胚胎发生和神经组织发育在内的一系列生物过程中起着关键作用。结合成分-靶点-通路网络可见CAMs通路主要参与靶点是HLA-DRB1和ICAM1。与HLA-DRB1相关的化学成分度值较小未做讨论。 ICAM-1又名CD54，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员，是介导黏附反应的一个重要黏附分子。大量研究表明，ICAM-1是心血管功能的关键调节因子，在心血管疾病的发生和发展中起着重要作用。此外，有研究表明ICAM-1在呼吸道炎症中也发挥着重要作用，ICAM-1/LFA-1的相互作用使炎症细胞与血管内皮细胞黏附并募集浸润至哮喘患者的支气管，启动哮喘气道炎症和气道高反应性[41]。本研究通过分析发现作用于ICAM1的主要成分为月桂酸单甘油酯和β-胡萝卜苷，但目前关于三七及其上述主要活性成分治疗呼吸道疾病的文献报道较少，为下一步将三七应用于呼吸道疾病发展过程中炎症的控制提供了新思路。 综上，本研究在分析三七主要化学成分的基础上，运用网络药理学的方法预测三七抗炎作用的潜在靶点及机制，发现人参皂苷Rh1、Rg1及monolaurin、β-daucosterol等抗炎活性成分，EGFR、STAT3、MAPK14、IL2等潜在靶点和癌症信号通路、细胞因子受体相互作用、CAMs等关键信号通路，为进一步开展三七抗炎机制研究和拓展临床应用提供依据。本研究也存在一些不足之处。因数据库中数据不够全面，获取的作用靶点不够精确等局限性，难以完全反映整体状况，且预测出的很多新靶点也需进一步的实验验证才更具说服力。 参考文献（略） 来 源： 庞会婷，罗朵生，郭 姣．三七化学成分分析及其抗炎机制的网络药理学探讨 [J]. 中草药, 2020, 51(21):5538-5547.
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