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在过去的十年中，大规模平行 DNA 测序和计算生物学的进步使人们对几乎所有主要癌症类型的基本突变过程有了前所未有的洞察力。两个主要的癌症基因组学联盟——癌症基因组图谱 (TCGA) 和国际癌症基因组联盟 (ICGC)——已经生成了丰富的突变、病理和临床数据数据库，可以通过基于网络的门户网站进行挖掘，从而进行相关研究和在强大的患者队列上测试新假设。 在本章中，我们将回顾这些技术发展对了解促进前列腺癌发生、进展、转移和临床侵袭的分子亚型的影响。特别是，我们将专注于定义临床相关患者队列的分子亚型，并评估更好地理解这些亚型（在体细胞和生殖系基因组中）如何影响被诊断患有前列腺癌的个体男性的临床过程。 （前列腺）癌基因组分析的挑战 2000 年，人类基因组计划发布了人类基因组序列的初稿[ 1 ]。人类基因组计划在 10 年的时间里使用成对末端 Sanger 测序通过全基因组鸟枪法测序组装而成，耗资约 30 亿美元，最初包含基因组的大部分常染色区域，冗余度非常低（即读取深度）。2000 年代中期大规模并行测序的发展以及随后对该技术的改进产生了三个主要影响：首先，可以对较大的目标序列进行测序，例如人类基因组 (~3000 Mb)，其数量相对较短时间；其次，这种测序的成本大大低于基于 Sanger 的方法（10 5到 10截至 2019 年减少6倍）；第三，每个碱基的通量时间和成本的减少允许进行高度冗余的测序，每个碱基可以被测序 30 次或更多次，从而增加对被调用碱基的信心，并允许改进对低频体细胞变异的检测。 然而，相对于使用源自纯化白细胞的 DNA 对生殖系基因组进行测序，癌症基因组测序提出了基本挑战。这是因为癌症的特征是随着时间的推移获得突变，以及在肿瘤进化过程中克隆细胞群的分化。虽然在肿瘤进化早期出现的突变将存在于由祖细胞产生的整个所得细胞克隆中，但在肿瘤进化后期发生的突变必然限于获得该突变后出现的亚克隆群体。这产生了种系基因组中不存在的基因组异质性。此外，来自原发性实体瘤的细胞群很少不受非恶性细胞类型的污染。例如基质、相邻的良性上皮等），从而降低了肿瘤相关突变等位基因的相对丰度——即使是那些克隆的——在混合的肿瘤-正常细胞群中。 由于这些原因，癌症基因组的准确分析通常需要比生殖系基因组分析高两到三倍的测序覆盖率。增加基因组中每个碱基的平均读数不仅可以增强对每个碱基调用的信心，而且还可以增加低频变异的可能性——无论是由于亚克隆性还是非恶性来源的基因组 DNA 污染——会被检测到。自然地，在测序覆盖深度、样本通量和每个癌症基因组测序的总成本之间存在权衡。癌症基因组的分析也依赖于同一个体的种系基因组序列的存在。这一点尤其重要，因为大多数肿瘤测序研究依赖于短（~100-150 bp）测序读数的映射，重叠最小，2 ]。鉴于这些挑战，第一个被测序的癌症基因组来源于液体肿瘤（如急性髓性白血病 [ 3 ] ）也就不足为奇了，其中可以通过使用基于流式细胞术的方法纯化不同的细胞群来减少或消除正常污染，并且可以使用来自相同生物样本的非恶性淋巴细胞轻松地对正常基因组进行测序。在这些癌症中，检测相同丰度突变所需的测序深度相对低于实体瘤，从而降低了每个基因组的总成本。 在癌症基因组测序的初期阶段，许多团队——尤其是那些研究实体瘤的团队——选择对癌症的整个外显子组进行测序，而不是基因组；癌症基因组图谱 (TCGA) 计划就是这种方法的典型代表。在全外显子组测序中，首先使用体外捕获方法从基因组 DNA 中纯化基因组的编码区。因为它们仅占整个基因组的约 2%，所以外显子组可以以相同的成本被测序到比基因组更高的深度（或者，同样的深度以降低成本）。因此，全外显子组测序允许检测低频编码比全基因组测序灵敏度高得多的变异。然而，这是以无法检测编码区之外的分子畸变或评估全基因组结构变异为代价的。正如我们将看到的，这对于分析 C 类癌症 [ 4 ] 非常重要，例如前列腺癌，其中非编码变异、基因拷贝数异常和结构变异是肿瘤发生和疾病进展的关键驱动因素。
前列腺癌基因组 在讨论前列腺癌基因组学时，区分局部和转移性疾病至关重要。在广泛的前列腺特异性抗原 (PSA) 基因组检测时代，绝大多数新诊断属于局部、低级别疾病，预后良好 [ 5 ]，原发性新发转移性疾病的诊断相对较少。在某些情况下，转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 在局部治疗（根治性前列腺切除术和/或放射治疗）和全身性雄激素剥夺治疗 (ADT) 均失败后发展，并且本身可能会接受额外的全身性治疗，例如多西紫杉醇[ 6]。相对于最初接种它们的原发性肿瘤，这些全身性疗法会诱导强大的选择压力，这可以改变转移性病变的基因组构成。事实上，最近的证据表明，在 ADT [ 7 ]期间，对特定分子改变的明确选择（阳性和阴性）。因此，将局部前列腺癌的分子景观与转移性疾病的分子景观根本不同是适当的。然而，正如我们将看到的，对前列腺癌发展、进展和临床侵袭性的重要见解可以从对局部的、未经治疗的疾病状态的深入分析中推断出来。局部前列腺癌的体细胞分子图谱传统上，局部前列腺癌的分子检测受到临床相关癌症相对缓慢的生长以及局灶异质性和低肿瘤细胞性的阻碍。这些限制限制了对具有足够高 DNA 产量的高细胞肿瘤进行深度下一代测序的分析。事实上，直到 2011 年 [ 8 ]，即第一个肿瘤全基因组 [ 3 ]（表1）发表几年后，局部前列腺癌全基因组景观的首次描述才出现。| 参考 | 测序的全基因组的数量和类型 | 重大意义 |
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| 伯杰等人[ 8 ] | 7种原发性高危肿瘤 | 首次对局部前列腺癌进行全基因组测序。闭环链重排的识别 | | 巴卡等人[ 24 ] | 55 个原发性肿瘤，2 个神经内分泌转移瘤 | 表征前列腺癌结构变异的时间变化（“chromoplexy”） | | Weischenfeldt 等人[ 26 ] | 11 个早发性原发性肿瘤
7 个老年性原发性肿瘤 | 50岁以下男性前列腺癌中富含雄激素依赖性结构变异 | | 癌症基因组图谱研究网络 [ 16 ] | 19个原发性肿瘤 | 局限性前列腺癌的分子亚类 | | 布特罗斯等人[ 57 ] | 来自 5 个原发性肿瘤的 23 个恶性病灶 | 局限性前列腺癌的空间异质性 | | 库珀等人[ 89 ] | 来自 3 个原发性肿瘤的 12 个恶性病灶 | 局限性前列腺癌的时空异质性。形态正常前列腺上皮异常的鉴定 | | 弗雷泽等人[ 25 ] | 200 种中等风险原发性肿瘤 | 迄今为止最大的前列腺癌全基因组研究。识别与不良临床结果相关的反复驱动畸变 | | 泰勒等人[ 65 ] | 来自 14 个种系BRCA2突变携带者 的 19 个病灶 | BRCA2突变携带者 的肿瘤基因组与去势抵抗性转移性疾病的基因组非常相似。MED12/MED12L 通路作为临床攻击的驱动因素 | | 卡马乔等人[ 131 ] | 103 原发肿瘤 | 评估体细胞全基因组拷贝数异常和拷贝数丢失机制 | | 任等人[ 38 ] | 来自中国男性的 65 例原发性肿瘤 | 中国前列腺癌中TMPRSS2:ERG融合的 低频率。鉴定新的肿瘤抑制基因 | | 埃斯皮里图等人[ 56 ] | 93 种中等风险原发性肿瘤 | 前列腺癌的时间演变分析。开发具有克隆性意识的不良临床结果的多模式生物标志物 | | 楔形等[ 37 ] | 87 个原发肿瘤，20 个转移灶 | 前列腺癌的时间演变。确定局部疾病中潜在的药物靶点 | | 苏等人[ 132 ] | 来自 2 个原发性肿瘤的 17 个细胞核 | 前列腺癌单核全基因组测序的首次报道。同一腺体内显着的空间异质性 | | 格豪泽等人[ 96 ] | 292 名 55 岁以下男性的原发性肿瘤 | 影响年轻男性前列腺癌早期演变的突变特征的表征。基于多模态分析的临床相关亚组的识别 |
TMPRSS2 和 ERG 基因的雄激素依赖性融合。TMPRSS2和ERG基因从染色体 21q22.3 的 (-) 链转录。TMPRSS2在其 5' 启动子/增强子区域（5'-ARE；紫色）中含有强雄激素反应元件。5'-ARE（通常是TMPRSS2的第一外显子的一小部分）与ERG癌基因的编码区融合产生融合产物（TMPRSS2:ERG；T2E），其中 ERG 表达在雄激素-响应方式。这可以通过荧光原位杂交 (FISH) 直接检测 [ 28]、RNA 或 DNA 测序、qPCR 或间接通过 ERG 免疫组织化学。在大约 50% 的情况下，T2E 融合伴随着插入序列的缺失（“edel”融合），而在另外 50% 的情况下，插入序列被保留，通常通过整合到其他染色体位置。这些可以使用分解鱼来区分 [ 15 ]TMPRSS2:ERG融合 (T2E) 存在于约 45% 的所有本地化 PC 中，而另外约 5-10% 的融合涉及另一个ETS家族原癌基因（例如ETV1、ETV4）[ 16 ]。TMPRSS2启动子和增强子区域（含有强雄激素反应元件 (AREs)）与 ERG 的 5' 末端融合导致雄激素驱动的 ERG 过表达，这可以通过针对 ERG 的免疫组织化学在临床标本中检测到 [ 17 , 18 ]。使用荧光原位杂交 (FISH) 和 qPCR [ 15 ]也很容易检测到T2E融合, 19 ]。分子异质性和亚克隆性研究一致表明，T2E融合是前列腺肿瘤发生中最早的分子事件之一 [ 20 ]。尽管如此，关于T2E在这方面的确切功能还没有出现清晰的画面。此外，大型研究未能确定T2E对局部疾病的不同临床结果的预后影响 [ 21 , 22 ]，尽管具有融合的肿瘤确实显示出独特的转录编程，导致依赖于 NOTCH 信号 [ 23 ]，这可能使T2E 是对 NOTCH 通路抑制剂敏感性的预测性生物标志物。前列腺癌基因组的标志单核苷酸变异前列腺癌是一种 C 级肿瘤，以缺乏驱动单核苷酸变异 (SNV) [ 4 ] 为代表。相对于其他实体瘤类型，局限性前列腺癌具有约 0.5–1 SNV/megabase [ 8 , 16 , 24 , 25 , 26 ] 的中间全球 SNV 负担。前列腺癌外显子组测序研究的荟萃分析表明，局部前列腺癌中最常见的突变基因包括SPOP、FOXA1和TP53 [ 25 ]。引人注目的是，在 >10-12% 的局部前列腺癌中没有单个基因发生突变 [ 25]，这与前列腺肿瘤发生主要由其他类型的分子畸变驱动的假设一致（见下文）。相比之下，mCRPC 每个肿瘤的非同义 SNV 比局部疾病多 2 到 3 倍，这与长期雄激素剥夺治疗期间获得额外突变和克隆选择一致 [ 7 , 27 , 28 , 29 ]。事实上，与局部前列腺癌相比，大多数体细胞驱动 SNV 在 mCRPC 中高度富集。有趣的是， SPOP中的主要例外是 SNV ，相对于 mCRPC，其在局部前列腺癌中显着富集，这表明这些突变是前列腺肿瘤发生的关键驱动因素，但不太可能推动进展 [ 7 ]。与这一假设一致，SPOP突变赋予对 CYP17A1 抑制剂阿比特龙的敏感性 [ 30 ]，这表明 ADT 可能对含有SPOP SNVs的原发性肿瘤克隆产生强烈的负选择。相反，雄激素受体 ( AR ) 基因中的 SNV 在局限性前列腺癌中极为罕见，但在 mCRPC 中普遍存在 [ 25 , 27 ]，这与 mCRPC 的雄激素非依赖性增殖一致。这种富集的可能机制是在含有 AR 突变的原发性肿瘤中阳性选择亚克隆，尽管这尚未在成对的原发性和转移性肿瘤组织的纵向研究中直接评估，以及从头选择的可能性不能排除 ADT 期间发生的突变。这样的研究需要超深度 WGS 或靶向重测序来校正肿瘤细胞性和低变异等位基因部分。更一般地说，这代表了当前所有癌症测序研究的一个基本限制：由于测序深度不足，假阴性率很高。然而，正如我们将看到的那样，这个问题的一个潜在解决方案是开发定制的靶向测序面板，同时了解现有的全基因组测序数据和基本的前列腺癌细胞生物学。结构变化作为C类肿瘤，前列腺癌基因组的特点是广泛的结构变异、基因重复和缺失、易位、倒位和小的插入和缺失（即Indels）。在本节中，我们将总结在前列腺癌基因组中发现的经常性驱动基因 GR 和拷贝数畸变 (CNA)，并讨论这种疾病典型的复杂结构变异。基因组重排如上所述，前列腺癌中最常见的 GR（也是最常见的分子畸变）是TMPRSS2基因的 5' 非翻译区 (UTR) 与ERG基因的编码区和 3'-UTR之间的融合，a ETS原癌基因家族的成员[ 14 ]。融合产物，称为TMPRSS2:ERG (T2E)，是通过上述 edel 或 esplit 机制生成的 [ 15 ]。TMPRSS2 5'-UTR 和上游增强子含有强 ARE，当与ERG编码区融合时，以雄激素依赖性方式驱动 ERG 蛋白的过表达 [ 14]。T2E 融合可以通过跨断点 qPCR、RNA 或 DNA 测序、阵列比较基因组杂交（aCGH；在 edel 融合的情况下）或荧光原位杂交 (FISH) [ 15 ] 检测，也可以通过根据免疫组织化学中 ERG 的过表达推断 [ 18 ]。T2E 是针对ETS原癌基因的更大基因融合家族的成员，这些基因融合在约 50-60% 的所有前列腺癌中被发现。该家族包括驱动ERG过表达的其他雄激素反应性 5' 伙伴（例如SLC45A3、NDRG1等）、TMPRSS2的替代 ETS 家族 3' 伙伴（例如ETV1、ETV4和FLI1）或独特的雄激素驱动融合（例如SLC45A3：ETV1 ) [ 16 , 24]。ETS 融合是前列腺肿瘤发生过程中最早发生的异常之一，ERG 的过表达可用于在免疫组织化学上确定肿瘤病灶内的独特克隆群体（见下文）[ 31 ]。虽然小分子 ERG 抑制剂已被开发并被提议作为具有 T2E 融合的前列腺癌的潜在治疗策略 [ 32 ]，但尚不清楚 T2E 是否有助于局部或转移性前列腺癌的不同临床过程。来自确定性、根治性放疗或手术治疗患者队列的证据表明，T2E 不能预测局部疾病的更具侵袭性的临床过程 [ 21 , 22]。相反，有一些证据表明TMPRSS2:ERG融合可能通过干扰非同源末端连接 (NHEJ) 来抑制 DNA 双链断裂修复，从而促进 PARP 抑制剂诱导的放射敏感性 [ 33 ]。然而，大量证据表明，ETS 融合是所有前列腺癌中超过一半的肿瘤发生的关键驱动因素，对疾病的临床进展仅有轻微影响。有趣的是，T2E 融合在诊断时年龄小于 50 岁的男性（即“早发”）[ 26 , 34 ] 中高度富集，这表明这些癌症代表了一种独特的分子亚型由雄激素依赖性信号驱动的基因组亚型。为此，一个未解决的关键问题是 T2E 和其他融合是否会推动新生前列腺癌的独特进化轨迹。这个问题可以通过新兴的大型、注释良好的患者队列的全基因组测序以及允许从单个肿瘤群体推断亚克隆进化的新计算算法来解决。 虽然ETS家族融合代表了最大的单一类别的前列腺癌相关 GR，但已经描述了其他异常，并且可能影响前列腺癌生物学和临床结果。例如，最近发现的含有PTEN肿瘤抑制基因的 10 号染色体上的复发性基因组倒位与PTEN mRNA 丰度和PTEN功能的显着降低相关，类似于在含有PTEN缺失的肿瘤中观察到的情况，这是最常见的前列腺癌中常见的 DNA 拷贝数畸变 (CNA)（见下文）[ 25]。在染色体 3q 的一个区域也观察到了类似的效果，这表明这是一种相对常见的 mRNA 丰度调节机制。PTEN表现出单倍体不足的肿瘤抑制因子的行为，由此通过缺失（见下文）或点突变使单个PTEN等位基因失活足以驱动PTEN介导的肿瘤发生 [ 35 ]。然而，事实上，这种效应可能是通过甲基化诱导的沉默或基因组倒位导致第二个等位基因的拷贝中性丢失来解释的。随着异形肿瘤数量的不断增加（从而增加统计能力），评估不同类别的畸变是否以及如何相互作用以失调PTEN将很重要。在RB1、GSK3B和FOXO1基因中也观察到重排，导致这些基因功能丧失 [ 24 ]。其他候选驱动事件包括NRF1 - BRAF和CRKL - MAPK1融合，虽然这些事件并不常见，但它们可能是个体肿瘤中的重要驱动事件。再一次，全面了解这些（和其他）遗传资源的频率，以及它们的生物学和临床影响，将需要显着增加可用于分析的局部前列腺癌全基因组的数量。 已经在非高加索血统人群的前列腺癌中发现了其他非ETS基因融合，包括 Y 染色体上的USP9Y和TTTY15基因之间的融合以及由 chr14:chr8 易位导致的CTAGE5 : KHDRBS3融合 [ 36 ]。在中国前列腺癌患者中，这些融合的存在率超过TMPRSS2:ERG [ 37 , 38 ]，这强烈表明遗传血统和环境因素在前列腺肿瘤发生的分子进展中起关键作用。 色差 一般来说，癌症相关基因融合涉及两个基因组位点；通常是基因的调节区，受强启动子控制，驱动原癌基因的组成型表达。这方面的典型例子是定义慢性粒细胞白血病 (CML) [ 39 ]的BCR-ABL融合和在各种恶性肿瘤中发现的IGH-MYC易位，包括伯基特淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病 [ 40 , 41 ]。然而，对癌症基因组结构的更好理解揭示了结构变异的其他复杂模式。一种这样的模式是“chromoplexy”，它最初是根据高级局部前列腺癌的深度全基因组测序确定的 [ 24 ]。Chromopplexy 涉及以“端到端”方式形成融合产物，其中包括来自多条染色体的 DNA。Chromoplexy 与 chromothripsis 的不同之处在于它通常涉及跨多个染色体的特定基因座的破坏，这似乎发生在单个基因组事件中。相反，染色体碎裂通常涉及少量染色体（通常是一个或两个）的广泛“破碎”和重新组装（图2）。在前列腺癌中 T2E 融合的某些情况下，色复合很重要，ETS 融合状态与色复合事件的存在、涉及的染色体数量以及每次融合的 DNA 片段数量密切相关 [ 24 , 37 ]。这表明前列腺肿瘤中的染色质可能与雄激素驱动的转录有关。虽然已在其他癌症类型中发现了铬复合物 [ 42 , 43 , 44 , 45 , 46 ]，但其在人类癌症中的总体频率尚未确定，其对这些癌症的临床演变和侵袭性的影响（如果有的话）也没有确定。.
前列腺癌中的复杂基因组重排。( a ) 染色体碎裂是单个染色体或单个染色体区域大量重排的结果，在少量细胞分裂期间。结果是染色质区域内的基因位点（显示为彩色条）的破坏，并保留了该区域内的基因拷贝数 [ 78 ]。（b）与 chromothripsis 相比，chromoplexy 涉及几个不同的基因座（显示为彩色条），通常跨越不同的染色体。这些基因座相互交换基因组片段，形成复杂的“闭环”结构，可能涉及五个或更多独立基因座 [ 24 ]拷贝数畸变 前列腺癌基因组具有广泛的复发性拷贝数畸变 (CNA) (表2 )。这些事件通常包括跨越数兆碱基的大染色体区域，尽管确实发生了一些局灶性 CNA (≤1 Mb)。在局部疾病中，一些成熟的肿瘤抑制基因会发生单等位基因或双等位基因缺失。最常观察到的缺失涉及10 号染色体上的PTEN基因座 [ 16 , 25 ]。PTEN丢失发生在约 15-20% 的局部前列腺癌中，通常发生在也含有 T2E 融合的肿瘤中 [ 16 ] 和缺氧肿瘤 [ 47 ]。此外，PTEN 缺失在转移性前列腺癌中富集 [ 7]，表明 PTEN 损失有助于疾病侵袭。PTEN的丢失导致 PI3K/AKT 通路的激活，从而促进细胞增殖、存活和迁移 [ 48 ]。有趣的是，PTEN -/-小鼠胚胎成纤维细胞对多聚 ADP 核糖聚合酶 (PARP) 抑制剂敏感 [ 49 , 50 , 51 , 52 ]，可能是通过 RAD51 的转录下调减少同源重组介导的 DNA 修复[ 53 ] . 然而，相关研究未能在前列腺癌中PTEN状态和 RAD51 表达之间建立任何联系 [ 54]，并且这种效应很可能是组织特异性的，因为后续基于集群的定期间隔短回文重复 (CRISPR) 筛选 PARP 抑制剂敏感性未能概括PTEN在这方面的重要性 [ 55 ]。局限性前列腺癌中的其他复发性体细胞缺失包括NKX3-1 (8p21.2；见下文)、CHD1 (5q15-q21.1)、CDH1 (16q22.1)、RB1 (13q14.2)、CDKN1B (12p13.1) , BRCA2 (13q13.1) 和TP53 (17p13.1) [ 16 , 25 , 56]，其中一些可能对局部疾病的不良结果具有重要的预后价值 [ 57 ]。| Gene | Aberration | Chromosomal locus | Frequency in localized prostate cancer |
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| PTEN | Deletion | 10q23.31 | 10–20% | | NKX3-1 | Deletion | 8p21.2 | 5–30% | | TP53 | Deletion | 17p13.1 | 4–20% | | FOXO1 | Deletion | 13q14.11 | 5–15% | | RB1 | Deletion | 13q14.2 | 5–15% | | MYC | Amplification | 8q24.21 | 6–10% | | CHD1 | Deletion | 5q15-q21.1 | 8–10% | | NBN | Amplification | 8q21.3 | 5–7% | | CDH1 | Deletion | 16q22.1 | 4–5% | | BRCA2 | Deletion | 13q13.1 | 3–5% | | CDKN1B | Deletion | 12p13.1 | 2–5% | | BRCA1 | Deletion | 17q21.31 | 1–2%
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色蓟马 在许多人类癌症中经常观察到色斑病，包括前列腺癌 [ 77 , 78 ]。这种现象涉及在很短的时间内（一个或最多几个细胞分裂）将单个染色体破碎成数千个小片段，这些小片段被随机重新连接，导致整个染色体或染色体臂的基因功能受到严重破坏（图2 ) . 染色体碎裂与杂合性保留和TP53缺失有关 [ 78 ]，尽管TP53等位基因丢失不是染色体碎裂所必需的 [ 79 ]。Chromothripsis 通常已在特设的方式，尽管已经开发和验证了计算工具来自动化这个过程并提供一个客观的标准，通过该标准可以识别和量化跨肿瘤类型的染色质 [ 79 ]。大量研究已确定局部前列腺癌中色素脱失的发生率相对较高，这与观察到的 C 级疾病的性质一致 [ 16 , 24 , 25 , 80 , 81 ]。Chromothripsis 与独特的基因融合和其他分子改变有关，因此可能是独特的前列腺癌生物学的基础 [ 25 , 81]，但与较高的肿瘤分级或局部前列腺癌的不同结果无关，这表明其功能与肿瘤的发生和维持有关，而不是与疾病侵袭有关。染色质肿瘤往往更大，并且在畸变类别中具有更高的突变负担，并且染色质区域富含异常的 DNA 甲基化，这增加了表观遗传机制可能有助于启动染色质碎裂的可能性 [ 25 ]。DNA损伤反应 有效的 DNA 损伤反应 (DDR) 对于维持基因组完整性至关重要。如上所述，增加前列腺癌风险的种系变异主要涉及 DNA 修复途径，这些基因中的变异几乎普遍与基因组不稳定性有关。DDR基因可以分成不同的通路，介导特定类型DNA损伤的修复。例如，错配修复 (MMR) 涉及纠正碱基替换，而同源重组 (HR) 使用可用的姐妹染色单体作为模板，在细胞周期的 S/G2 阶段进行无错误的 DNA 双链断裂修复。除了种系变异外，DDR 基因中还描述了多种体细胞改变，这些改变描绘了局部和转移性肿瘤中不同的前列腺癌基因组亚型。82 ]。 HR基因的改变突出了具有高度基因组不稳定性和结构重排的前列腺肿瘤的一个独特子集。大约 10-20% 的局部肿瘤表现出 HR 基因的改变，主要在BRCA2和ATM中，但也在BRCA1、ATR、FANCA、FANCD2、MRE11A、PALB2和RAD51C [ 7、16、25 ]中。有趣的是，转移性肿瘤中 HR 缺陷的比例增加到 23-27% [ 28 ]，这与转移性肿瘤中基因组不稳定性增加有关 [ 37]。与此一致，较高的 DDR 评分与局部前列腺癌的无进展生存期降低有关 [ 83 ]。DDR 缺陷型前列腺肿瘤的另一个子集涉及转移性肿瘤中CDK12的双等位基因丢失，并与高水平的局灶串联重复相关，并描绘了一个免疫学样亚组 [ 84 ]。总体而言，DDR 通路基因的改变形成了通常预后不良的不同前列腺肿瘤亚组。
肿瘤进化和体细胞基因组异质性的影响多焦点 绝大多数前列腺切除术标本显示出不止一个病灶 [ 85 , 86 ]，尽管直到最近还不清楚这些病灶是来自常见的前体克隆还是代表独立的癌症谱系。对来自 5 名局限性前列腺癌患者的 18 个独特肿瘤病灶进行宏观解剖揭示了跨分子畸变类别的显着的前列腺内基因组异质性 [ 57 , 87 ]。例如，在一些患者中，全球 CNA 计数在肿瘤病灶之间的差异高达 50 倍。这包括PTEN、NKX3-1和TP53等基因中的异质 CNA ，它们已确定预后价值 [ 62 , 63]。这意味着临床相关的分子谱分析存在显着的抽样偏差。重要的是，至少在一名患者中，两个不同的肿瘤区域之间没有共享的 SNV 或 CNA，至少在可用的检测限度内。这表明单个前列腺包含多种独立的癌症。 除了遗传变异性之外，五个前列腺肿瘤的多区域取样在几个位点显示出广泛的表观遗传肿瘤内变异性 [ 88 ]。特别是，与雄激素受体结合的增强子位点表现出显着的肿瘤内 DNA 甲基化异质性。这意味着遗传异质性不仅仅导致在病灶之间观察到的表型差异。使用 T2E 分解 FISH 来定义整体标本中的独特肿瘤区域，一项同期研究 [ 89 ] 进一步证明了多灶性前列腺癌中广泛的基因组异质性。虽然本研究中的每个肿瘤都来自单个祖先克隆，但在同一患者的肿瘤病灶中发现了独特的突变特征，这表明突变过程在肿瘤进化过程中有所不同，这与随后的报告一致，即获得独特的亚克隆突变是由突变特征组成的时间变化驱动的 [ 56 ]。最近，对来自 41 名局限性前列腺癌患者的 153 份标本（包括来自每位患者的正常前列腺上皮标本）的全外显子组测序揭示了广泛的基因组异质性，无论是在个体之间，还是在同一个体的肿瘤病灶之间 [ 90 ]]。来自同一前列腺的大多数病灶不包含共享的 SNV，并且很少有共享的 CNA。这项研究的一个局限性是，外显子组测序的使用排除了非编码突变的分析，尽管许多（但不是全部）非编码突变比非同义外显子突变受到的选择压力要小。因此，该研究不允许基于计算的亚克隆重建或克隆起源评估（见下文）。然而，这些数据确实表明，至少，独立的肿瘤病灶在前列腺肿瘤发生过程中经历了实质性的进化分歧。此外，最近对来自 10 名患者的 21 个转移灶进行的全基因组检查发现了RB1的多个不同变化，作为相关转移的晚期和亚克隆事件，与 28% 的 mCRPC [ 91 ] 中的异质表达相关。这一发现与另一项研究一致，该研究表明转移性前列腺肿瘤的RB1 [ 7 ] 变化多 3 到 4 倍，并暗示一组选定的患者需要RB1失活才能进展为 mCRPC。 因此，虽然现在很清楚多灶性与显着的分子异质性相关，但这对差异生物学、临床过程和转移进展的贡献程度仍然未知。例如，虽然存在高级别癌症（即Gleason 模式 ≥4）与不太有利的临床结果相关，但有证据表明，在由异质病理分级（即Gleason 模式 3 与模式 4 相邻）组成的肿瘤中，较低级别至少在某些情况下，成分可以引发远处转移[ 92]。不幸的是，这些观察结果仅限于单一的“n of one”研究。虽然给定患者的所有转移性病变都来自原发性肿瘤内出现的单个祖细胞克隆 [ 93]，迫切需要澄清多灶性原发性肿瘤中“致命”克隆的来源。这可以部分通过纵向研究评估多个原发灶和患者匹配的远处转移性疾病的分子谱来实现。这将有助于确定从最大/最高级别“指数”病变中播种的转移灶的比例，从而表明需要多区域分析在多大程度上为使用预后和/或预测性分子生物标志物的临床决策提供信息（见下文）。有趣的是，最近的一项研究表明，约 24% 的患者匹配指数病变和淋巴结转移没有表现出常见的 CNA [ 94]。虽然这项研究的样本量（n = 30 名患者）和分子检查的广度有限，但这一发现确实支持了这样的假设，即一小部分但显着比例的转移来自于指数病变之外的肿瘤克隆。局部前列腺癌的亚克隆重建 虽然来自同一前列腺的多个癌症病灶的分子分析极大地增强了我们对局部疾病空间异质性的理解，但计算生物学的进步已经允许重建单个癌症病灶的时间演变（图3），这种方法是通过分析乳腺癌全基因组开创了先河 [ 95]。这种方法依赖于三个基本数据：（1）与患者匹配的正常 DNA 的全基因组序列以确定种系基因型，（2）准确测量肿瘤细胞性和全基因组拷贝数以确定变异等位基因频率， (3) 足够深的肿瘤全基因组测序（≥80-100×平均覆盖率）以检测稀有等位基因。在足够高的深度，这种方法可以区分肿瘤发生早期出现的突变，因此存在于克隆干中的突变与出现在亚克隆分支中的突变（即高与低等位基因频率）。当构成分支的突变相互排斥时，可以推断亚克隆分支是完全独立的（即从未在同一 DNA 片段上观察到）。因此，肿瘤可以分为单克隆（即所有细胞都包含大致相同的一组躯干突变等位基因）或多克隆（即不同细胞群包含具有或多或少进化“距离”的躯干和分支突变的混合物）。
局限性前列腺癌的亚克隆进化。克隆进化始于启动损伤，例如TMPRSS2:ERG融合（和其他ETS家族融合）、SPOP SNV 和CHD1缺失（在融合阴性肿瘤中），以及更广泛的基因组重排事件，例如染色复合。因为这些异常发生在肿瘤发展的早期，它们在肿瘤“主干”中富集，因此在临床表现时存在于所有肿瘤克隆中。在进化分化之前发生的其他躯干事件包括MYC扩增、NKX3-1、PTEN和TP53缺失、TP53、FOXA1和ATM SNVs 和 chromothripsis。一般来说，肿瘤主干因大量缺失和更高的 SNV 负担而富集。随着时间的推移，会出现与主干的分歧，从而产生包含主干畸变和私人“分支”突变（如AKT1和CCND1扩增）的亚克隆群体，这些突变仅存在于这些亚克隆中。具有更广泛分支的肿瘤在确定性治疗后更有可能复发 [ 56 ]。在肿瘤进化过程中（未显示），突变特征也有显着的转变，从早期 APOBEC 类型和衰老相关特征转向同源重组缺陷的特征 大约 40% 的局部前列腺癌具有单个克隆群体，而约 60% 显示出显着进化分支的有力证据 ，尽管这可能被低估了，因为本研究中的克隆群体是从单个肿瘤区域重建的。此外，特定的突变类别显示出对肿瘤主干或分支的强烈偏见。例如，虽然 CNA 负荷在分支和树干之间均匀分布，但树干 CNA 强烈倾向于更大的等位基因损失。相反，在肿瘤分支中出现的 CNA 往往是较小的等位基因增益。类似地，SNV 在肿瘤干中高度富集。事实上，几乎所有已建立的经常性驱动 SNV（例如FOXA1、SPOP、ATM和TP53）优先在肿瘤躯干中发现，表明这些畸变在肿瘤起始中起重要作用。突变特征在肿瘤进化过程中也是高度动态的，约 2/3 的肿瘤显示出特征转换的有力证据。最早的前列腺癌相关突变是由 APOBEC 相关的“时钟样”突变特征驱动的，随后积累了与 AR 相关的畸变、DNA 修复缺陷和更广泛的基因组不稳定性 [ 96 ]。 重要的是，克隆复杂性是临床结果的重要预测指标。与单克隆肿瘤相比，多克隆肿瘤的生化复发时间大大缩短 [ 56 ]。此外，肿瘤克隆性与现有的基于单分子分析物的预后生物标志物有很强的相互作用，例如基因组改变的百分比 (PGA) 或多模式生物标志物（分子生物标志物的实用性将在下面的“临床基因组学”部分详细讨论） . 相对于融合阴性癌症 [ 37 ] ，具有ETS基因融合的肿瘤的时间演化和选择压力也存在明显差异。例如，ETS融合阳性癌症在 5 号和 10 号染色体（包括PTEN基因座）上的特定缺失非常丰富，但与包含CHD1的染色体 5 区域的缺失互斥，这与 CHD1 形成的要求一致。融合[ 58 ]。在未来几年，每个测序碱基成本的持续下降将允许对肿瘤亚克隆进行更深入的研究，从而克服这一过程中的一些固有限制。例如，很有可能推定的单克隆前列腺肿瘤实际上确实包含具有独特私人突变集的少量细胞，但在当今常用的测序深度下无法检测到。同时，计算能力的提高将进一步提高检测低频等位基因的灵敏度。此外，整合来自多区域样本的测序数据，然后对每个前列腺肿瘤进行克隆重建，将有助于更全面地了解克隆动力学[ 97、98]。这具有多种临床意义，包括识别和跟踪从肿瘤、血液或尿液样本中取样时预测治疗耐药或复发的超低频突变 [ 99 ]。最后，随着文献中测序前列腺肿瘤的数量不断增加——伴随着检测罕见但反复出现异常的统计能力的增加——对进一步全基因组测序分析的需求将会下降，除非在独特的患者群体中基因组景观尚未完全确定（例如BRCA2相关的家族性前列腺癌；见下文）[ 64 , 65 ]。
家族性前列腺癌和生殖-体细胞相互作用生殖系变异和前列腺癌风险 家族史是前列腺癌发展的一个重要风险因素 [ 100 ]，这表明遗传的遗传因素会影响前列腺癌发病的倾向。虽然据估计约 10% 的前列腺癌是由遗传因素引起的 [ 101 ]，但很少有个别基因显示出显着贡献。一个突出的例子是BRCA2基因。有害种系BRCA2突变的携带者患前列腺癌的可能性是非携带者的四到五倍 [ 102 ]，尽管外显率不完整（即并非所有携带者都会患上前列腺癌）。此外，这些癌症非常具有侵袭性，被诊断为前列腺癌的BRCA2突变携带者的 5 年总生存率为 50-60% [ 66 ]。中度外显率可能增加前列腺癌风险的其他突变包括BRCA1、PALB2、HOXB13、CHEK2、ATM、KLK6和NBN [ 103 , 104]。导致风险相对较大增加的基因几乎普遍参与了 DNA 损伤反应 (DDR) 和 DNA 修复，这些基因中存在种系突变的患者可能适合使用多聚 (ADP)-核糖聚合酶 (PARP) 抑制剂进行治疗。通过同源重组选择性地靶向DNA双链断裂修复缺陷的细胞[ 105 ]。事实上，PARP 抑制剂已显示出治疗具有 DDR 基因种系和/或体细胞突变的 mCRPC 患者的前景 [ 106 ]。 虽然这些中度外显基因中的有害突变会导致前列腺癌风险相对较大的增加，但这些突变在大多数人群中很少见。相比之下，超过 100 个种系单核苷酸多态性 (SNP) 与前列腺癌风险增加有关。虽然每个单独的 SNP 只会增加非常小的风险，但这些 SNP 加起来占患前列腺癌的遗传风险的 28% 以上 [ 107 , 108]。表征这些 SNP 的影响需要对非常大的人群进行全基因组关联研究 (GWAS)，以便获得足够的统计能力来检测风险的微小变化。为此，研究基因组中癌症相关改变的前列腺癌协会小组 (PRACTICAL) 联盟汇集了超过 120,000 例前列腺癌病例和 100,000 例对照，从而对遗传变异对前列腺癌风险的影响提供了前所未有的见解 [ 107 , 108 ]。种系-体细胞相互作用：BRCA2 虽然生殖系基因型明显影响前列腺癌的临床病程，但直到最近，人们对携带有害生殖系突变的男性疾病侵袭的分子基础知之甚少。这种知识差距可以部分解释为预示不良临床结果的突变频率相对较低，这必然限制了统计能力。我们对BRCA2突变携带者前列腺癌基因组学的大部分理解来自于在 mCRPC 的大型全外显子组研究中偶然收集的病例中观察到的相关性 [ 28 ]，根据定义，它是一种疾病状态，其中体细胞基因组谱已被受到强烈的 ADT 介导的选择压力。因此，这些BRCA2是否以及如何相关癌症与散发性（即非家族性）前列腺癌不同，但在局部于前列腺——并且在 ADT 给药之前——直到最近才得到全面解决。BRCA2相关的前列腺癌在所有分子类别中都具有显着更高的突变负担，相对于匹配等级和阶段的散发性癌症 [ 65 ]。特别是，相对于散发性局部疾病，MYC 的扩增和GSK3B和MTOR的缺失在BRCA2相关的前列腺癌中显着富集[ 64 , 65 ]。事实上，激素初治的、局部的、与BRCA2相关的前列腺癌具有突变特征，与散发性局部疾病相比，它更类似于mCRPC [ 16、25、28]。这包括 CNA 和参与WNT通路激活的基因的异常甲基化（包括MED12、MED12L和APC），这在散发性、局限性前列腺癌中很少见 [ 65 ]。有趣的是，BRCA2相关的前列腺癌富含一种独特的组织病理学，称为前列腺导管内癌 (IDC-P)，这是这种疾病状态的临床侵袭性的主要组成部分 [ 66 , 109]。IDC-P 患者表现出基因组不稳定性增加，更有可能患有低氧肿瘤，并表现出更高的 SChLAP1 长非编码 RNA 表达和体细胞改变比例增加，例如TP53、SPOP和FOXA1的点突变[ 110]。尽管如此，仍不清楚 IDC-P 与周围浸润性腺癌有何不同，尽管大量证据表明 IDC-P 相关癌症是基因组不稳定的实体。为了正式评估这个问题，还需要更多的统计学上的研究，直接比较 IDC-P 和邻近浸润性腺癌的显微解剖区域的基因组改变。在存在或不存在种系BRCA2突变的情况下，IDC-P 的亚克隆重建揭示了这些侵袭性癌症的独特进化轨迹。此外，无论 IDC-P 状态如何，IDC-P 相关的散发性癌症通常都存在富含 BRCA2 相关疾病的分子异常 [ 65 ]。 关于BRCA2相关前列腺癌的许多问题仍未得到解答。例如，尚不清楚BRCA2携带者中组织学上正常的前列腺上皮细胞是否含有易于发生快速恶性转化的突变，这种现象已在一些散发性癌症中观察到，与前列腺“场癌化”现象一致 [ 89 ]。同样，与其他种系突变相关的前列腺癌临床侵袭性的分子基础在很大程度上是未知的。从这些患者（尤其是早期疾病患者）收集标本将有助于创建强大的队列来剖析这些家族性癌症的独特生物学。
临床基因组学 随着文献中前列腺癌全基因组和全外显子组数据集数量的增加，我们对疾病发展和进展的关键分子事件的理解也在增加。然而，这些分子研究中的大多数都缺乏长期的临床随访数据，因此难以确定特定基因组改变与临床结果之间的关系。因此，虽然一些基于 RNA 的不良结果生物标志物已进入临床实践（在本书的下一章中进行了回顾），并且许多基因组畸变与不良病理终点有关（例如前列腺切除术的 Gleason 升级），支持使用复发性基因组改变（或一组改变）作为不良临床终点的生物标志物的数据相对较少，例如 3 年生化复发、10 年转移性复发或前列腺癌特异性死亡率. 在本节中，我们回顾了有关基于 DNA 的临床结果预测因子的文献。预后生物标志物：CNA 和基因组改变的百分比 在 2010 年具有里程碑意义的论文中，Taylor 及其同事对 181 种局部前列腺癌进行了分子分析，并根据 CNA 分析确定了六个患者集群 [ 111 ]。CNA 数量最多的患者（第 5 组）的生化复发时间明显短于其他患者，尽管各组之间的临床和病理异质性排除了对肿瘤分级和 CNA 数量对临床结果的相对贡献的稳健多变量评估。随后的研究表明，PGA 是局部前列腺癌疾病复发的阴性预后因素，与肿瘤分级和其他临床预后因素无关 [ 74 , 75 ]，这一发现已在各种癌症类型中得到验证 [112 ]。 然而，PGA 的预后价值似乎并不是随机分布在整个基因组中，因为一些（但不是全部）CNA 与不良结果相关。例如，染色体 8q24 的扩增（包含编码 cMYC 和 PCAT1 长非编码 RNA 的基因）与不良临床结果相关 [ 68 ]，染色体 8p21.2 的缺失也与NKX3-1肿瘤有关抑制基因，染色体 10q23.31，其中包含PTEN肿瘤抑制基因 [ 62 , 63 ]，和染色体 17p13.1，其中包括TP53基因 [ 113 , 114]。最近，对来自 aCGH 和 SNP 微阵列的 DNA 拷贝数数据的无偏分析已经确定了准确分类处于生化和转移复发高风险的患者的多区域特征。对来自单指数肿瘤活检的 aCGH 数据使用无偏机器学习，开发了一个 100 位点特征，可以准确预测接受图像引导放射治疗的低/中风险患者的复发 [ 74 ]。重要的是，这一特征预测了 18 个月的生化复发，这是致命疾病的替代指标 [ 115 , 116 ]，并与肿瘤内缺氧等其他不良临床因素协同作用 [ 74 ]]。该特征随后被细化为 30 位点版本，可准确预测局部前列腺癌独立队列中的生化和转移性复发，跨越临床风险和治疗范围 [ 76 ]。预后生物标志物：多模式分析的影响 这些基于 DNA 拷贝数的生物标志物和特征表明，基因组异常可以区分惰性和侵袭性局部疾病。然而，这些特征并没有捕捉到临床结果中观察到的所有异质性，这表明来自其他分子畸变类别的信息提供了改进的特征准确性。 事实上，一个机器学习模型对局部前列腺癌的 40 个基因组和表观基因组驱动因素进行了训练，确定了一个六特征、多模式特征，可以准确预测中度风险疾病的早期和整体生化复发 [ 25 ]。该特征由两个表观遗传异常（ACTL6B和TCER1L基因位点的甲基化）、两个结构变异（MYC 扩增和涉及 7 号染色体的易位）、一个非同义突变（ATM SNV）和临床 T 阶段组成，优于其他建立了用于预测生化复发的单类生物标志物（例如 CNA），分类准确度约为 83%。事实上，添加肿瘤亚克隆数据进一步提高了这一特征的性能 [ 56]。因此，具有单克隆肿瘤和低特征评分的患者在确定治疗后的 8 年内几乎没有生化复发，而具有高特征评分的多克隆肿瘤非常具有侵袭性，3 年生化复发率约为 40% 和近 80%的患者在 8 年内经历生化复发。分子生物标志物实施的挑战 随着 DNA 测序成本的持续下降，临床和研究肿瘤标本的全基因组测序对于越来越多的研究人员来说将变得可行。然而，基因组学成本的下降并没有反映在计算和数据存储硬件成本的下降上。此外，劳动力成本占分析和注释基因组序列的总成本的很大一部分。最后，正如我们所见，亚克隆进化和疾病异质性可以深刻影响个体患者的临床过程，因此需要进行相对深度的测序来检测罕见的变异等位基因。因此，常规的全基因组或全转录组测序对于广泛的临床实施可能不可行，即使直接测序成本可以忽略不计。 因此，需要制定有效平衡化验成本、测试准确性和治疗影响的临床询问策略。此外，多模式生物标志物的性能可能优于基于单一分子分析物开发的那些，因此临床相关平台必须能够有效整合不同的分子畸变类别。这一挑战的一个潜在解决方案是开发定制的靶向测序面板，其中包括与局部前列腺癌相关的所有编码和非编码基因组区域。随着已测序的前列腺癌基因组数量增加到数千个以上，将很快达到发现存在 1% 或更高的分子变异的统计能力（并且已经达到了某些突变类别，例如 SNV），尽管发现能力的进一步增加将需要成倍增加的患者数量。包含这些反复出现的变异体的基因组位点——在体细胞和种系基因组中——可以包含在定制的捕获分析中，并被测序到极高的深度（高达 500 倍）。如果这样的分析包含 50 Mb 的定制捕获并被测序到 500 倍的平均覆盖率，那么这将仅产生典型 60 倍全基因组序列所需的总测序量的约 13%。因此，这样的平台将大大减少分析所需的存储和计算资源，并且对于临床有用的生物标志物至关重要，将大大减少生成“可操作”信息所需的时间。此外，高测序深度将允许检测稀有变异， 目前有几个因素限制了设计这种面板的能力。一个主要因素是目前我们对前列腺癌基因组中罕见但反复出现的变异的理解受到限制。最大化临床影响需要适用于尽可能多的患者群体，因此将基因组区域限制在突变率为 1% 或更高的区域将必然无法在多达 1% 的病例中识别相关突变。然而，捕获面板可以以迭代方式设计，随着额外验证研究数据的开发，包括新区域（或改进或删除旧区域）。第二个限制是与分子畸变类别的兼容性。例如，独特位点的异常DNA甲基化与不同的临床结果相关。因此，侵袭性疾病的信息生物标志物可能至少包括一些有关 DNA 甲基化的信息，因此应考虑靶向测序面板与亚硫酸氢盐转化的 DNA 的兼容性。异质性 如前所述，不同的前列腺癌病灶可能具有广泛的基因组异质性。淋巴结转移中的 CNA 与匹配的指数病变 [ 94 ] 之间的不一致强调了这一点的临床相关性。相比之下，基于单个活检或手术切除标本的生物标志物可以实现非常高的预后准确度，通常超过80 % [ 25、56、74、76]。然而，目前尚不清楚这一水平的生物标志物准确性是否可以通过分析额外的分析物和开发额外的多模式特征来进一步扩展，或者生物标志物的准确性是否从根本上受到前列腺内异质性的限制。这是转化前列腺癌基因组学中一个尚未解决的主要问题，需要对异质性的影响有深入的了解，以优化最终实现临床应用的任何基于组织的生物标志物。一种潜在的解决方案是使用基于液体的生物标志物来补充组织生物标志物，因为这些可能更好地反映跨肿瘤病灶的全局突变谱，并且似乎准确地反映了源肿瘤的突变谱[ 127、128、129, 130 ]。然而，迄今为止，这些研究仅限于大体积 mCRPC，并且对局部前列腺癌的适用性 - 特别是低级别和分期的前列腺癌 - 尚不清楚。技术改进无疑将提高局部疾病中循环游离 DNA 检测的灵敏度，这可能有助于克服原发肿瘤异质性的影响。
结论表征局部前列腺癌的基本分子畸变现在已被充分了解。很明显，一般而言，这种疾病状态的典型特征是驱动 SNV 的低至中度负担、广泛的基因组重排和表观遗传失调。此外，随着具有深厚临床病史和随访数据的注释良好、测序病例的数量不断增加，预后和预测性生物标志物的开发——通过分子谱分析——也将增加。疾病异质性分析——无论是患者之间还是单个前列腺内——仍然是一项重大的研究挑战，并且绝对需要充分了解异质性的影响，以最大限度地发挥分子生物标志物的潜在临床影响。
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