水产常用芽孢杆菌产酶、耗氧及耐盐性能评估

大量研究表明，芽孢杆菌对养殖动物残饵、粪便的分解、转化及养殖水体的调节有明显作用，因其具有安全、环保、无抗性的特点，在水产养殖中被广泛应用。而芽孢杆菌产酶并提高动物对饲料的利用率是其发挥作用的重要机制之一，但水产养殖环境多变，在不同溶氧、盐度等理化条件下，芽孢杆菌能否发挥作用一直备受养殖户质疑。本文就水产养殖常用芽孢杆菌产酶、耗氧及耐盐性能进行评估，以期为产品开发和现场使用提供一定的参考价值。

1、材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

菌种包括3株枯草芽孢杆菌（编号枯草1、枯草2、枯草3）、1株短小芽孢杆菌、1株解淀粉芽孢杆菌、1株地衣芽孢杆菌和1株侧孢芽孢杆菌为青岛根源生物集团水产常用菌株，其菌粉为根源生物集团生产车间生产。

1.1.2 培养基及试剂

营养琼脂培养基：购自北京陆桥，121℃灭菌30min；

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1L，pH7.0，121℃灭菌30min；

酪素培养基：干酪素10g，酵母膏1g，琼脂20 g，水1L，pH7.0，121℃灭菌30min；

淀粉培养基：可溶性淀粉2g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，水1L，pH7.2，121℃灭菌30min；

酸性汞试剂：HgCl₂ 15g，浓HCl 20mL，水100mL。

卢戈氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，水300mL。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾中，待碘全溶后，加足水分即可。

1.2 实验方法

1.2.1 产酶能力测定

从-20℃冰箱取出保藏的菌种甘油管，用接种环挑取一环菌液在营养琼脂培养基上三区划线，于37℃培养24h分离出单菌落。使用灭菌牙签挑取平板上的单菌落，分别点种在酪素培养基和淀粉培养基上，6菌/平板，其中试验菌株5个，参照菌株1个位于平板中间，于37 ℃培养箱中培养24 h。在酪素培养基菌落周围滴加适量酸性汞试剂测定产蛋白酶能力，在淀粉培养基上滴加卢戈氏碘液测定产淀粉酶能力。采用游标卡尺测量菌落及透明圈直径的大小，计算透明圈直径/菌落直径的校正圈菌比，比值越大，表示该菌产该酶的活力越大，其中：校正圈菌比=平板内试验菌株圈菌比平均值/平板内参照菌株圈菌比×参照菌株圈菌比平均值。

1.2.2 耗氧评估

按根源企标将7株试验菌株菌粉分别计数，每个样品6个平行，其中3个直接放于37℃恒温培养箱正常培养24h，另外3个放于厌氧罐中于37℃恒温培养箱中厌氧培养24h，以厌氧培养菌量留存率表示该菌株厌氧存活能力，其中：厌氧培养留存率=厌氧培养菌量/正常培养菌量×100%。

1.2.3 耐盐性能评估

用接种环挑取平板上单菌落接种到盛有100 mL的LB液体培养基中，于37 ℃，200 r/min的摇床上振荡培养12 h，作为种子。按3%接种量接种到盛有100ml、盐度为30‰的LB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养，每隔4h取适量样品，稀释适当倍数，用分光光度计测定600 nm处吸光值，控制吸光值在0.3-0.6之间，用相同稀释倍数的LB培养基作为对照。以培养时间为横坐标，吸光值OD600为纵坐标，制作生长曲线图。

2、结果与分析

2.1 产酶能力测定结果

受称量误差、产酶培养基厚薄和培养基中有效成分分布等因素影响，同一菌株在同一批配制的不同平板上以及在不同批配制的平板上透明圈与菌落差异很大，不同菌株更是难以对比产酶能力。本次试验引入参照菌株，以校正圈菌比衡量产酶能力，尽可能地提高纵向测定的准确度（图1）。试验表明，选取的7株芽孢杆菌除侧孢芽孢杆菌外均可产蛋白酶，其中产蛋白酶能力：枯草1＞短小＞解淀粉＞地衣＞枯草2＞枯草3＞侧孢，各菌株产淀粉酶能力普遍弱于产蛋白酶能力，枯草1产淀粉酶能力最强，枯草2、解淀粉和地衣次之，枯草3、短小和侧孢芽孢杆菌基本不产（表1）。

表1 菌株产酶能力测定

图1 产酶透明圈

（左侧为蛋白酶，右侧为淀粉酶）

2.2 耗氧测定结果

以菌株正常有氧培养菌量为参照，测定其完全厌氧条件下的菌量留存率，结果表明枯草1、枯草2、短小和解淀粉仅在有氧条件下生长，为严格好氧菌。枯草3、地衣和侧孢在有氧无氧条件下均可生长，为兼性厌氧菌，其中枯草3厌氧菌量留存率最高，为97%，侧孢和地衣芽孢杆菌次之，分别为43%和26%（表2）。在完全厌氧条件下计数平板上的菌落不仅数量有明显差异，同样培养时间菌落大小和形态也有明显区别（图2）。

表2 不同菌株厌氧培养菌量留存率

图2 菌株厌氧和耗氧培养菌落差异

2.3 耐盐测定结果

试验菌株在前期评测中发现在低盐度条件下均能良好生长，本次试验主要评估其在30‰的高盐度条件下的生长性能。结果显示，侧孢芽孢杆菌在高盐度下基本难以生长，其余试验菌株均可正常生长。其中枯草3调整期最短，最快进入对数期，28h生物量居于第二，即该菌株实际使用可最快发挥作用。地衣芽孢杆菌启动较慢（4-8h），但一旦进入对数期便可快速增殖，在28h生物量最高，OD600可达6.76，枯草1、枯草2、解淀粉和短小生长曲线相差不大，居于中间位置（图3）。

图3 不同菌株生长曲线对比

3、结语

水产养殖市场芽孢杆菌产品多种多样，但每种芽孢杆菌的功能侧重点都有所不同，如枯草芽孢杆菌主要用于分解有机物，降低氨氮和亚硝酸盐，地衣芽孢杆菌主要用于促生长、改善肠道菌群，侧孢芽孢杆菌主要用于抑制蓝藻等。但许多养殖户似乎陷入了宣传陷阱，认为凡是叫芽孢杆菌的都是同一种芽孢杆菌，于是比菌量比价格成为了他们选购产品的重要衡量指标，至于芽孢杆菌进入不同理化条件的养殖水体中能否发挥作用以及发挥多大作用并不太受重视。须知每种芽孢杆菌的营养需求及繁殖条件均有所差异，期待任何芽孢杆菌在任何水体中均能发挥稳定的效果是不可取的。当然，我国水产养殖用微生态制剂的应用研究仍处于初级阶段，实际应用肯定会存在一定的盲目性，但养殖户勤于监测养殖水体指标，动保企业加强研发实力、正确宣传并指导养殖户科学使用微生态制剂是必不可少的，要知道当养殖户使用微生态产品只是寻求心理安慰时，微生态动保企业也必定难以持久发展。 

END