基于2021指南的ER阳性乳腺癌Ki67精准检测——2022 USCAP乳腺病理前沿进展来袭！

基于2021指南的ER阳性乳腺癌Ki67精准检测——2022 USCAP乳腺病理前沿进展来袭！

Ki67是乳腺癌常用的增殖标记物，2011年国际乳腺癌 Ki67 工作组（IKWG）首次发布了乳腺癌Ki67评估指南，以确定Ki67免疫组化的分析有效性。但美国癌症联合委员会 （American Joint Committee on Cancer，AJCC）等权威指南依然对Ki67免疫组化的分析有效性存在质疑，使它的临床实用性受到了一定的限制。2021年IKWG对此进行了更新并指出，建立规范化的处理流程和评估方法可以有效提高Ki67的分析有效性；在判断早期乳腺癌患者预后方面确实具有临床有效性；其临床实用性仅限于ER阳性HER2阴性且具有良好解剖预后的早期乳腺癌患者，当Ki67增殖指数≤5%或≥30%时，无需进行多基因表达谱的检测。但目前仍存在一些临床实际问题：如何通过人工智能辅助自动化评分系统提高评估的精确度；是否可以通过Ki67或可替代Ki67免疫组化的基因检测确定肿瘤细胞增殖的临床意义；如何确定与临床预后相关性更好的阈值；是否可以通过连续性监测Ki67作为临床试验的早期终点，以确定新的治疗是否有效。

      2022年的USCAP乳腺病理有2个以Ki67检测为主要内容的口头发言，分别为来自美国斯隆凯特林癌症纪念中心的Melissa Krystel-Whittemore教授团队的“The Utility of Ki67 Quantification to Triage OncotypeDX Testing in Breast Cancer”和韩国首尔多家研究中心的Hyeon Seok Yang教授团队的“Ki67 Index Regression Using Fully Convolutional Regression Network and Cancer Area Segmentation Network”，分别关注于Ki67免疫组化检测的临床实用性及分析有效性。其它有10个口头发言只是将Ki67作为预测或预后因素之一进行了简要的阐述，主要关注于Ki67检测的临床有效性及临床实用性。

1. The Utility of Ki67 Quantification to Triage OncotypeDX Testing in Breast Cancer

研究团队：美国斯隆·凯特琳纪念肿瘤中心的Melissa Krystel-Whittemore教授团队

这项研究的目的是比较Ki67免疫组化评估和Magee评分（MS）在ER阳性/HER2阴性早期乳腺癌进行OncotypeDX（ODx）检测类选的有效性。

该研究人群包括57例连续性T1-2 、N0-1 ER阳性/HER2阴性浸润性乳腺癌，均进行了ODx检测。使用两种克隆抗体 (MIB和30-9)对手术切除标本的全组织切片进行Ki67免疫组化检测。对每例切片Ki67热点区域进行高倍镜（400X）的观察。3名病理学家和3种图像分析工具分别对Ki67增殖指数进行量化评估。Ki67指数及后续计算均采用上述评估方法。利用Ki67评估结果和临床病理资料计算患者的MS。对基于IKWG指南评估的Ki67指数和MS评分的类选效力进行了比较。利用ODx检测结果作为对照，对MS评分和Ki67指数的敏感性和特异性进行了比较。结果发现：Ki67 MIB和30-9克隆的中位数值分别为15%(范围14-18%)和26%(范围25-30%)。分别根据Ki67 IKWG指南和Magee评分标准对基因组分析进行类选，该队列中51%和75%的病例不建议进行ODx检测。不同克隆抗体Ki67评估指数和MS对ODx检测类选效力的敏感性和特异性分别为：30-9克隆Ki67评估指数的敏感性80%、特异性20%，MS的敏感性75%、特异性100%；MIB克隆Ki67评估指数的敏感性57%、特异性45%，MS的敏感性75%、特异性100%（图1）。

图1

由此该研究团队得出的结论：Ki67 30-9克隆的Ki67指数高于MIB。与IKWG指南Ki67热点评估相比，MS的敏感性和特异性显著更高。Ki67 30-9克隆指数<5%的肿瘤可以很好地预测低ODx RS，然而，两个克隆Ki67指数>30%来预测高ODx RS具有较高的假阳性率。IKWG指南Ki67指数评估的低特异性可能是使用热点而不是全切片评估的结果。进一步比较热点和全切片Ki67评估的优劣性，可以为提高Ki67评估指导ODx检测类选效力提供更多的意见。

2. Ki67 Index Regression Using Fully Convolutional Regression Network and Cancer Area Segmentation Network

研究团队：韩国Deep Bio Inc.等中心的Hyeon Seok Yang（梁玄錫）教授团队

这项研究的目的是提出一种基于深度学习的方法，利用全卷积回归网络 (FCRN)和肿瘤区域分割网络这两种方法自动估计Ki67指数，评估其准确性。

研究的数据集来自乳腺癌切除标本的Ki-67免疫组化染色切片，使用两台显微镜摄像机在40倍物镜下进行图像采集。由有经验的病理学家对阳性（DAB）和阴性（H）肿瘤细胞进行标注，在这些细胞标注的基础上再进行肿瘤区域标注。使用FCRN检测染色细胞，使用DeepLabV3对肿瘤区域进行分割。数据集被分成训练集: 8、调整集: 1和验证集: 1。在训练过程中，进行数据增强(颜色抖动、随机翻转、随机旋转)。采用随机梯度下降(SGD)优化器训练FCRN，初始学习率0.001，均方误差(MSE)损失为200 epoch。DeepLabV3训练使用Adam算法，初始学习率为0.002，BCEWithLogitsLoss，早停法。

研究人员测量了肿瘤区域分割前后的平均绝对误差(MAE)和Ki-67指数的判定系数，结果发现阳性细胞判读的误差从16.36减小到15.43，而阴性细胞判读的误差从38.12降至35.55。在判定系数方面，阳性细胞由0.934提高到0.942，阴性细胞由0.943提高到0.943，而Ki67指数由0.980提高到0.983（图2）。由此研究人员得出结论：通过对肿瘤区域进行自动分割，使Ki-67指数的自动计算更加准确。通过扩展和学习各种类型的数据集，可以提高计算的准确性。

图2

3. 其它主要关注于Ki67检测的临床有效性及临床实用性的研究

      美国Montefiore Medical Center的Susan Fineberg教授团队的研究“EZH2 Expression and Response to Neoadjuvant Endocrine Therapy in Estrogen Receptor Positive Invasive Breast Cancer”探讨了EZH2表达与新辅助内分泌治疗（NET）疗效的相关性。对治疗前活检标本和治疗后切除标本进行了Ki67免疫组化检测，并根据国际Ki67工作组指南的全切片加权评分进行评分。根据治疗前活检标本的Ki67增殖指数，分为低风险组（≤30%）及高风险组（＞30%）。研究结果表明，高风险组患者穿刺活检标本的EZH2蛋白表达水平与NET耐药相关（图3）。

图3

  美国University of Pittsburgh Medical Center的Kanika Goel教授团队的研究“Triple Negative Breast Cancers Not Subjected to Neoadjuvant Chemotherapy: What’s Prognostic and What’s Not?”对139例未接受新辅助治疗的三阴性乳腺癌（TNBC）的临床病理特征与无复发生存率（RFS）及乳腺癌特异性生存率（BCSS）的相关性进行了研究，发现AR阳性表达与更高的RFS相关，但与BCSS无关。AR阳性TNBC的Ki67增值指数较低。

  我国复旦大学肿瘤医院杨文涛教授团队的研究“Characterization of Estrogen Receptor Low Positive/Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Negative Breast Cancer ”对ER低表达乳腺癌进行了详细的研究发现，ER低表达/ her2阴性肿瘤的临床病理特征与TNBC肿瘤相似，但组织学分级和Ki67指数明显高于ER>10%/her2阴性肿瘤。FOXC1表达与侵袭性表型显著相关，这一类乳腺癌具有较高的组织学分级(p=0.01)和Ki67指数(p<0.001)（图4）。因此，FOXC1检测可能有助于识别内在分子分型，并在ER低表达/ her2阴性患者的内分泌治疗决策中作为ER检测的补充。

图4

  美国Rush University Medical Center 的Mamoor Latef教授团队的研究“ Correlation of Axillary Nodal Metastasis with Tubular Morphology in Invasive Breast Carcinoma”发现，单纯浸润性管状癌 (PITC)的淋巴结转移率（LNM）低于具有管状特征的浸润性导管癌(IDCTF，管状形态<90%)和1级浸润性非特殊性癌（IDC, NST），但无显著性差异。影响LNM的最重要因素是肿瘤分期，≥5 mm肿瘤LNM较高。包括Ki67在内的预后标志物与LNM无关。

我国河北医科大学第四医院刘月平教授团队的研究“Development and Validation of an Artificial Intelligence Model for Predicting the Status of ER Low-Positive Breast Cancer”利用人工智能提取浸润性癌细胞的形态特征，结合患者的临床病理特征，基于朴素贝叶斯分类算法，建立ER表达状态预测模型。研究结果发现，在ER低表达乳腺癌中，高组织学分级和Ki67高表达的患者更有可能出现阴性预测结果，无法从内分泌治疗中获益，预后较差（图5）。

图5

法国Gustave Roussy, Cancer Campus的Charlie Saillard及Ingrid Garberis教授团队的研究“ Explainable Deep Learning Predicts Molecular Subtypes and Improves Risk of Relapse Assessment from Invasive Breast Cancer Histological Slides”旨在开发可解释的深度学习(Deep Learning, DL)模型，能够利用HE染色的全数字切片图像（1）预测肿瘤的免疫表型以及（2）结合临床数据预测肿瘤的远期复发。结果发现，DL模型能够预测免疫表型，ER的AUROC为0.90，PR为0.76，HER2为0.89，Ki67为0.85。

      以上是2022年的USCAP乳腺病理Ki67检测方面研究的简要介绍，这些研究结果表明Ki67在判断早期乳腺癌预后方面具有临床有效性，但是Ki67的临床实用性比较有限，对于其它预期用途，目前没有足够的高水平证据支持其常规使用。包括Ki67在内的多参数模型有助于扩展其临床实用性。应用人工智能自动化评分系统可以提高Ki67评估的分析有效性。在确保Ki67分析有效性的前提下开展有关其临床实用性的研究大有可为。

作者简介

刘毅强 

北京大学肿瘤医院病理科 科副主任，副主任医师，医学博士

CSCO肾癌专家委员会委员

中华医学会病理学分会第十三届乳腺疾病学组委员

中国研究型医院学会分子诊断医学专业委员会常务委员

中国医药教育协会乳腺疾病专业委员会乳腺癌多学科诊疗学组委员

中国医药教育协会骨与软组织肿瘤专业委员会委员

北京医学会病理学分会第十届委员会乳腺病理学组委员

北京医学会病理学分会第二届青年委员会委员

          江海峰             

宁夏医科大学总医院病理科，主治医师，医学博士

宁夏抗癌协会青年理事会理事

周玮玮

河北沧州市中心医院病理科  副主任医师  硕士研究生

北京癌症防治学会乳腺癌个体化诊疗及MDT专业委员会委员

河北预防医学会医学产学研协同发展促进分会委员

河北省沧州市肿瘤防治联合会肿瘤放射治疗分会委员

河北省沧州市女医师协会乳腺疾病专委会主委

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