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——背景—— 根据WHO的国际癌症研究机构发布的2020年全球癌症报告显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中我国新发癌症病例457万例（占比23.7%），死亡病例300万例（占比30.2%）。其中，发病数前五的癌症分别为肺癌（82万），结直肠癌（56万），胃癌（48万），乳腺癌（42万），肝癌（41万）；死亡人数前五的则是肺癌（71万），肝癌（39万），胃癌（37万），食管癌（30万），结直肠癌（29万）。肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC，85%）和小细胞肺癌（15%）。中国的NSCLC患者中，30%-40%携带EGFR突变。EGFR是一个非常重要的基因，编码的蛋白为表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR)。EGFR控制着很多细胞的生长，其功能是短期且受到严格控制的。但在一些肺癌细胞中，EGFR基因发生了突变，导致其不能被正常关闭，无休止地刺激细胞生长，最终导致癌症发生。因此，研发EGFR靶向药对肺癌患者而言是非常重要的。图1所示为目前上市的EGFR靶向药的结构及在中美两国的上市时间。超过90%的EGFR突变为21号外显子L858R突变或19号外显子缺失。第一代EGFR靶向药吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）和埃克替尼（Icotinib）就是针对以上两种突变。但就像之前介绍ALK靶向药提到的一样，一代EGFR靶向药大概用一年就会出现耐药。其中超过一半的耐药是因为出现了新的T790M突变。第二代EGFR靶向药有阿法替尼（Afatinib）、达克替尼（Dacomitinib）。它们是共价抑制剂，会不可逆的结合EGFR从而有更持久的药效，但其对野生型EGFR也有很高的活性从而带来较强的副作用如皮疹和腹泻。第三代EGFR靶向药有奥希替尼（Osimertinib）、阿美替尼和伏美替尼。它们除了同为共价抑制剂外，还对T790M耐药有效。不难看出，同一代EGFR靶向药的结构都很相似。研发第三代EGFR靶向药的目的是为了得到对EGFR的常见突变和T790M突变都有效，但对野生型EGFR活性较弱的抑制剂。根据NCCN发布的2021v1版，奥希替尼是EGFR阳性NSCLC中优先级最高的一线治疗药物（图2）。今天给大家介绍一下第三代EGFR抑制剂奥希替尼的研发故事。
图2. NCCN发布的EGFR阳性NSCLC患者的一线治疗指南。 第二代共价抑制剂是在吉非替尼的苯胺喹唑啉模板的基础上开发的，这些抑制剂含有丙烯酰胺官能团，共价靶向位于激酶溶剂通道的Cys-797。共价机制可以增强化合物对靶标的亲和力，使化合物有更强的活性。然而，Cys-797存在于所有野生和突变型的EGFR中，第二代EGFR靶向药不仅对突变型EGFR具有更高的活性，而且对野生型EGFR也具有更高的活性。抑制野生型EGFR对靶向药的临床疗效并无帮助，但会导致患者发生皮疹和腹泻等副作用。因此，研究人员的目标是开发对L858R/T790M双突变体（Double Mutant，DM），激活突变体（Activating Mutant，AM）的EGFR有强活性，而对野生型（Wild-Type，WT）EGFR活性较弱的第三代EGFR靶向药。 ——先导化合物的发现—— 研究人员首先测试了一些已上市或发表的EGFR抑制剂对DM、AM和WT的细胞活性(表1)。从表中明显看出，Gefitinib和Erlotinib对WT有活性，对AM有更大的活性，但对DM的细胞活性显著降低（分别为3.3和7.6 μM）。相比之下，Afatinib和Dacomitinib对WT和AM的活性增加，同时对DM的活性增加。然而，这些化合物对WT的活性高于DM（即DM/WT margin<1）。WZ-4002（Dana-Farber癌症研究所此前报道的基于嘧啶骨架的EGFR抑制剂）对DM和AM的活性接近，都远高于WT的活性。 表1. 已发表的EGFR抑制剂的细胞活性
DM选择性骨架的筛选 为了进一步筛选对DM有选择性的骨架，研究人员分别从CRO和阿斯利康内部选择一组化合物进行了测试（如图3）。图3中蓝色的点则为对DM具有选择性的化合物，它们的共同特征是有嘧啶骨架。其中一个典型的化合物（表2中的化合物7)包含一个吲哚基团，对DM的IC50为0.009 μM，对WT的选择性为88倍。但7的对DM细胞的IC50活性只有0.77 μM，酶到细胞的活性下降约90倍。分子改造的思路是将7转为共价抑制剂，以期增强DM细胞活性的同时保持对WT的内在选择性。
图3. 化合物对EGFR野生型(WT)和T790M/L858R(DM)的生化抑制数据。红色点表示可逆的EGFR抑制剂，黄色点表示共价的EGFR抑制剂，蓝色点表示阿斯利康内部选定的化合物。化合物活性用pIC50表示。 表2. WZ-4002和化合物7的结构及7的活性数据
基于结构的靶向Cys-797分子设计 研究人员使用GLIDE模拟EGFR-T790M蛋白与化合物7的结合模式（如图4），并基于该结合模式进行药物设计。研究人员假设结合模式为分子的嘧啶核与激酶的hinge形成氢键（特别是与Met-793形成氢键），氯取代基指向蛋氨酸gatekeeper，苯胺基团朝向ATP口袋的溶剂通道，并在hinge上形成一个额外的氢键。从结合模式看到，苯胺的间位离Cys-797较近，适合通过形成共价键来靶向Cys-797。针对苯胺的间位，研究人员合成了基于丙烯酰胺的化合物8和9，它们在AM和DM中显示出比WT更强的细胞活性（表3）。尤其是化合物9，酶活和细胞活性明显比化合物7更强。
图4. 化合物7与EGFR野生型的模拟结合结构。 表3. 含丙烯酰胺共价基团的靶向Cys-797抑制剂的活性数据
有趣的是，将丙烯酰胺移至对位（化合物10）、丙烯酰胺连接在二氢吲哚环上（化合物11）或者引入腈基（化合物12）后，化合物的细胞活性都很低（见表4），表明只有合适的位置和合适的基团才适合与EGFR的半胱氨酸形成共价。 表4. 探究共价键相互作用SAR的活性数据
研究人员随后得到了化合物9与EGFR的共晶结构（如图5），表明化合物确实与Cys-797形成了共价键，也证明了早期建模工作的可靠性。
图5. 化合物9与EGFR野生型的共晶结构（PDB:4LI5） 减少化合物的亲脂性 上述化合物亲脂性较高（LogD7.4 >4.3），这往往会导致较差的理化性质和药代动力学。因此需要在保留EGFR效力和选择性的同时降低总体亲脂性。研究人员选择两个骨架进行研究（表5的骨架A和B），同时探究芳香取代基的影响（如表5）。其中，R1为吡咯并吡啶的骨架A化合物13在DM和AM细胞中保持了合理的效价（IC50为0.033和0.15 μM），DM/WT选择性也提高到了390，但LogD7.4明显偏高。骨架B的化合物14和15虽然活性下降2-3倍，但LogD7.4明显降低。由于15的总效价、选择性和理化性质（LLE值为3.4）更突出，研究人员选择15作为该骨架的关键探针化合物。LLE即ligand lipophilicity efficiency（配体亲脂性效率，一般数值越大越好），计算公式为：LLE (DM) = pIC50 DM (cell) − LogD7.4。 表5. 改良化合物的活性和亲脂性数据 研究5号位取代基对嘧啶骨架的影响。 根据模型预测，嘧啶骨架的5号位取代基靠近gatekeeper附近，研究人员认为这个位置对化合物的效价和选择性有较大影响。最初的5号位取代基上的氯原子是相对亲脂的，因此改变该基团提供了降低化合物亲脂性的可能性。如表6所示，除了H取代外，合成的系列化合物的LLE（DM）大多在3.4至3.5。将化合物15的Cl替换为H（化合物16），LogD7.4降低了一个数量级，LLE提升到4，但DM细胞活性降至0.25 μM。 表6. 探讨嘧啶5-取代基位置(R1)对活性和亲脂性的影响
调控化合物的反应活性 共价抑制剂的效力受分子与蛋白质的可逆结合（Ki）以及分子与活性位点的残基共价结合的能力（kinact）相关。因此，化合物对活性位点残基（在本例中为半胱氨酸）的化学反应活性是很重要的，同时要避免反应活性过高可能导致的脱靶效应。研究人员通过化合物与谷胱甘肽（GSH）反应的二级速率常数（kGSH）来评估硫醇的反应活性。为了确定影响化合物反应性的结构和电子特征，研究人员首先研究了含芳香环的丙烯酰胺系列化合物。这一系列化合物具有较好的水溶性，能避免因沉淀问题而引起的反应动力学复杂性。图6中的Hammett图可以定量地理解丙烯酰胺R1位置施加的电子效应即σ值和GSH的反应性之间的关系，可以看出反应的速率kGSH取决于丙烯酰胺R1基团的吸电子能力。R1基团的诱导效应（以σmeta或σind表示）可以用ρ值（分别为5.56和9.23）来确定硫醇的反应活性。R1的电子吸引与羰基共轭的效果一致，都有利于烯醇化过渡态的稳定。值得注意的是，在丙烯酰胺的α和β位（即R3和R4）引入甲基后与GSH没有发生反应。 表7. 芳烃系列化合物与GSH的反应性研究
图6. σmeta和σind值与化合物反应性(Log kGSH)的Hammett图。 为了寻找一个合适的“反应窗口”，研究人员分析了化合物的GSH反应性与DM细胞的pIC50之间的关系（如图7）。可以发现，Log kGSH (M−1 s−1)与DM细胞的pIC50的相关性很一般（R2为0.52, RMS为0.53)，这是因为“非共价结合”（Ki）对化合物的效价起到关键作用而非“共价结合”。不过普遍的趋势是反应活性高的化合物其pIC50往往也高，而pIC50值>7的化合物大部分的GSH半衰期<400分钟。因此，研究人员以400分钟作为“反应窗口”的下限，以二代EGFR抑制剂Afatinib的反应半衰期（25分钟）作为上限。
图7. Log kGSH (M−1s−1)与DM细胞的pIC50关系图。虚线表示“反应窗口”。 先导化合物的进一步优化 借鉴WZ-4002和化合物7的哌嗪取代基，研究人员合成了一系列苯胺对位为哌嗪取代基的化合物。研究人员认为与丙烯酰胺相邻的哌嗪的加入会影响两个取代基的构象和几何形状。随着哌嗪取代基的加入，化合物的效价普遍提高（见表8）。化合物56在AM和DM的细胞活性均强于15（AM活性为0.14 μM vs 0.4 μM，DM活性为0.019 μM vs 0.096 μM），DM/WT的选择性提升至620（15为240），LLE增至4.1（15为3.4）。此外，化合物56 (半衰期为188 min)与GSH的反应活性也比15(半衰期为352 min)略有增加，这与哌嗪为吸电子基团（σmeta 0.09 vs σmeta 0.07）是一致的。去除氯原子的化合物57的DM细胞活性从之前的0.019 μM降至0.071 μM，AM活性则基本不变。此外，吲哚基团相比吡咯并吡啶基团对AM和DM的活性和理化性质更好，如58的LLE高达4.6。但58和59的DM/WT选择性明显下降（140和19倍)。分子的活性和DM/WT选择性如何更好的权衡，还需要进一步的评估。 表8. 含哌嗪基团的化合物的活性和亲脂性数据
化合物15的体内疗效 由于化合物15具有可接受的活性和药代动力学性质，研究人员认为其能作为合适的体内概念验证化合物。15在H1975（DM细胞系）、PC9（AM细胞系)中显示了良好的抗增殖活性（DM、AM的EC50分别为0.099、0.14）和DM/WT选择性。随后在免疫缺陷小鼠中进行药效研究，每天口服化合物15 60 mg/kg（配方为甲磺酸盐），使用H1975（DM细胞系）、PC9（AM细胞系）和A431（WT细胞系）的小鼠模型的7天后总生长抑制率（TGI）分别为105%、134%和46%。相比之下，Gefitinib则分别为8%、142%和79%，说明化合物15在小鼠模型上对DM的活性和DM/WT选择性比Gefitinib都要好很多。 表9. 化合物15的活性、理化和PK数据
表10. 化合物15与Gefitinib在小鼠体内的疗效数据
化合物15的激酶选择性 研究人员测试了化合物15在浓度为1 μM下对70多种激酶的活性，其中10种激酶显示出>75% 的抑制作用。其中，对IGF1R的抑制程度最高（98%）。然而，这些激酶当中只有BTK在相同位置上有半胱氨酸，因此大多数是基于可逆机制的抑制模式。化合物15的激酶选择性还需要进一步评估。 ——讨论与总结—— 阿斯利康的研究人员从WZ-4002的结构出发，通过内部化合物库筛选到了非共价化合物7作为起始结构，通过模拟EGFR-T790M蛋白与化合物7的结合模式，设计得到共价化合物9。通过以调控活性、选择性、减少化合物的亲脂性和平衡化合物的反应活性为主要目标，研究人员得到了活性、选择性和亲脂性均不错的化合物15。然而，由于相对较差的溶解度 (1.6 μM) 和较强的 hERG （IC50为4.2 μM，可能会导致心脏毒性）和IGF1R（可能会导致血糖偏高）抑制活性，化合物15需要进一步的分子改造才能成为PCC。（未完待续） 参考文献： |
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