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大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。 2022年8月22日，德国海德堡大学Daniela Mauceri在《Cells》杂志发表了“Role of Epigenetic Mechanisms in Chronic Pain”的综述文章，讨论了DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等表观遗传机制对慢性疼痛的影响。
期刊：Cells 日期：2022.08.22 IF：7.666 /Q2 摘要 疼痛对人的生活感觉影响非常大，通常由组织损伤引起。在损伤处理后疼痛持续长时间时，即变成病理性疼痛。导致急性疼痛向慢性疼痛转变的确切分子和细胞机制尚不清楚。慢性疼痛与疼痛有关的神经通路发生一些可塑性事件。这些持久的适应性变化通过改变相关基因表达来实现。在神经系统适应过程中基因转录的不同调节因子中，表观遗传机制起着重要作用。本综述首先概述了表观遗传过程及其调控的主要类别，然后重点介绍表观遗传研究在不同形式慢性疼痛中的关键发现和未解决的问题。 表观遗传机制 表观遗传机制在不直接影响遗传密码的情况下调控基因表达。几年前，神经表观遗传学这一术语被引入，适应神经系统中的表观遗传学机制与它们在印记、遗传性或细胞命运决定中的作用可能截然不同。研究最多的是包括DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（PTM）在内调节染色质状态的表观遗传学机制。所有表观遗传标记的总和构成了表观基因组，并在DNA缩合中起着关键作用。 （1）DNA甲基化 甲基（CH3）基团与DNA的共价加成发生在甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的嘧啶环5′碳位胞嘧啶上。受影响的胞嘧啶主要位于CpG岛，至少200bp的DNA区域位于基因启动子周围。 DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNMT）引起。哺乳动物中存在几种DNMT，并根据其首选的DNA底物和甲基化模式分类。De novo DNMT、DNMT3a和DNMT3b在未甲基化的CpG位点上添加了新的甲基化标记，与DNMT1类似的维持性DNMT负责维持已经建立的甲基化标记（图1A）。如果一条DNA链上的胞嘧啶被甲基化，将触发DNMT1使用半甲基化DNA作为底物，使反链上的相应胞嘧啶甲基化。细胞可确保在DNA损伤或细胞分裂的情况下甲基化标记的自我维持。DNMT1有三种常见亚型（DNMT1s、DNMT1o、DNMT1 p），De novo DNMTs也有多种亚型（DNMT3a1、DNMT3a2、DNMT3b1），在DNMT3a条件下，变体源自位于DNMT3a基因座的内含子启动子。除三个常见的DNMT外，另有两个非典型家族成员DNMT2、DNMT3L不具有DNMT催化活性。DNMT2主要作为tRNA甲基转移酶，而DNMT3L增加了DNMT3A和DNMT3B的催化活性。在结构水平上，DNMT通常具有N-末端调节域，随后是位于C-末端的催化域。此外，它们具有与染色质、DNA和其他参与基因转录调控的蛋白互作结构域。
图1：DNA甲基化
鉴于甲基化共价稳定性，DNA甲基化此前被认为永久性不变。然而DNA去甲基化可以以被动或主动形式发生。在细胞分裂过程没有维持DNA甲基化的情况下， DNA被动去甲基化。神经元有丝分裂后，细胞DNA去甲基化活化。一些研究证据表明，DNA去甲基化在神经系统中是一个动态过程，在与神经元DNA去甲基化有关的表观遗传erasers中，生长停滞和DNA损伤诱导（GADD）了45蛋白（GADD45A和GADD45B）和Tet家族（图1A,B）。DNA去甲基化酶在神经系统的适应和不适应过程中发挥重要作用。 甲基化DNA主要通过两种机制调控基因表达：甲基胞嘧啶由于空间位阻而抑制转录因子的结合，或被具有甲基结合域（MBD）的蛋白识别，进而招募具有染色质重塑能力的蛋白、转录因子或转录抑制因子。DNA甲基化表观遗传标记的最佳研究和表征readers——甲基CpG结合蛋白-2（MeCP2），在发育和成长期均参与多种神经元功能调节。此前研究表明DNA甲基化与紧密染色质和转录抑制有关，胞嘧啶甲基化可导致转录因子与其结合位点分离，并促进甲基CpG结合蛋白（MBPs）结合，MBPs可招募共抑制复合体。但最近研究表明根据基因组位置，DNA甲基化也可导致基因表达诱导，DNA甲基化不一定等于转录抑制，越来越多证据支持DNA甲基化可能使基因组允许对外部刺激诱发反应。 （2）组蛋白修饰 组蛋白在其突出的N-尾上经历过多的PTM（图2A）可逆修饰，其状态由具有拮抗功能的酶调控，这些酶将添加（writers）或敲除（erasers）修饰。PTM影响组蛋白与DNA和其他蛋白互作，从而促进或抑制转录。甲基化和乙酰化是组蛋白最常见的PTM。
图2：组蛋白翻译后修饰和染色质状态。
组蛋白上的赖氨酸和精氨酸残基可以在多价状态下甲基化。精氨酸可以是一个或两个甲基，而赖氨酸残基可以是单甲基化，二甲基化或三甲基化。不同的甲基化水平和模式通过增加或降低DNA-组蛋白互作改变染色质结构，从而导致基因转录的激活或抑制。最具特征的组蛋白甲基化标记是赖氨酸4上的组蛋白3（H3K4），主要在活性转录基因的转录起始位点富集。当三甲基化时，该位点促进染色质松动并促进转录因子招募，而H3K27是基因表达抑制的标志。根据底物残基分类，甲基转移酶家族包括精氨酸和赖氨酸甲基转移酶，组蛋白甲基化长期以来和DNA甲基化一样被认为是一种永久的表观遗传标记。但最新证据表明，组蛋白去甲基化是一个非常动态和精细调节的过程。从底物和反应机制来看，去甲基化酶分为两大家族：赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶（LSD）和Jumonji-C（JMJC）去甲基化酶， 其中LSD1是第一个被鉴定的去甲基化酶。 除甲基化之外，组蛋白上的赖氨酸残基也可乙酰化。将乙酰基添加到带正电的赖氨酸残基上，会导致组蛋白与带负电的DNA静电亲和性降低，使染色质结构向松弛方向移动，从而促进转录（图2B）。乙酰基的敲除通常与染色质的紧密状态和转录抑制相关。乙酰基通过组蛋白乙酰转移酶（HAT）转移，如p300/CBP（CREB（cAMP反应元件结合）结合蛋白），其中，乙酰CoA作为辅因子（图2B）。HAT不仅作用于组蛋白，还作用于一系列蛋白，包括非核蛋白，被称为K-乙酰转移酶（KAT）。KAT数量众多，根据其亚细胞定位和结构分为亚组，乙酰化标记的erasers是组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases ,HDAC；图2B）。 HDAC是一个由18种蛋白组成的家族，根据其结构域和辅因子的作用分为两大类：锌依赖性HDAC（包括HDAC I、II、IV类）和III类NAD依赖性sirtuins（SIRT 1-7）。HDAC I类包含HDAC1、2、3、8，HDAC II类分为IIa（HDAC4、5、7、9）和IIb（HDAC6、10）；HDAC IV类的唯一成员是HDAC11（图3A）。II a类家族成员表现出影响其活性的特定行为，可以以信号依赖的方式在细胞核和细胞质之间穿梭。在锥体神经元中，II a类HDAC的亚细胞穿梭受突触活性和核钙调控（图3B）。在中枢神经系统中，HAT和HDAC活性之间的平衡诱导或抑制基因转录，调控发育过程，并在衰老和神经退行性疾病以及适应过程中发挥作用。组蛋白上乙酰化赖氨酸readers包含特定结构域，如溴结构域（bromodomain,BRD）、双植物同源结构域（double plant homeodomain ,PHD）fingers和Yeats结构域。
图3：组蛋白去乙酰化酶（HDAC）
（3）非编码RNA（Noncoding RNA,ncRNA） 非编码（nc）元件占人类基因组的大部分，nc元件可以对包括生理功能在内的功能发挥调控作用。根据长度ncRNA分为两类：短ncRNA（小于200bp）和长ncRNA（大于200bp,lncRNA）。短ncRNA包括miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、snRNA/snoRNA（small nuclear and nucleolar RNA）、tiRNA（transcription initiation RNA），rRNA（ribosomal RNA）和piRNA（piwi-interacting RNA）。LncRNA包括ncRNA扩增重复序列（expansion repeats）、天然反义转录本（natural antisense transcripts）和增强子RNA基因间ncRNA（enhancer RNA intergenic ncRNA）。 短ncRNA类研究较多的是单链、长19-22bp的miRNA，可以通过触发特定mRNA的降解来抑制基因表达。miRNA可靶向一个或多个mRNA，且可调节高达60%的编码基因。在神经系统中，miRNA表达方式取决于大脑区域以及发育阶段。miRNA是结构和功能可塑性等不同适应过程中的关键调节因子。 lncRNAs与mRNA一样，由RNA聚合酶II产生后进行加工，其二级结构定义了与基因组DNA或蛋白互作。lncRNA是基因表达的重要调节因子，包括染色质修饰、印迹、RNA剪接、与转录因子互作、翻译调控和核转运。 慢性疼痛的表观遗传机制 基因表达诱导或抑制维持慢性疼痛的不适应性变化，在疼痛处理的所有主要解剖区域中发现的变化通常受表观遗传调控（图4），其中负责检测伤害性刺激（如热、冷、压力或酸）的第一个部位是外周感觉神经元，双极神经元在背根神经节（DRG）的体细胞，轴突末端位于外周，可将伤害性输入传递到中枢神经系统（CNS）的脊髓。感觉神经元的过度兴奋是多种慢性疼痛的特征之一。疼痛处理通路的第二站是脊髓背角，其接收来自外周的输入并将信息传递到更高级别，参与不同疼痛模式和慢性疼痛的特定脑区和脑回路仍有待确定。在慢性疼痛转录的表观遗传调节背景下，大多数研究集中于外周感觉神经元或脊髓神经元，而有一小部分报告了慢性疼痛大脑区域的表观遗传介导转录。从机制上讲，转录的表观遗传调控支持具有不同作用模式的慢性疼痛可塑性：① 通过调节关键通路表达来改变相关回路的兴奋性；② 诱导或抑制突触后受体和信号分子的表达；③ 促进不适应性的结构可塑性，如在突触接触或传递水平；④ 通过影响其反应性来改变将在疼痛介导中招募的细胞数量。
图4：慢性疼痛的表观遗传机制 DNA甲基化水平、染色质结构和ncRNA变化可能影响不同基因表达，从而促进中枢和外周疼痛回路具有持久的可塑性，并最终导致慢性疼痛。 （1）慢性疼痛与DNA甲基化 在损伤后数周慢性神经性疼痛的动物模型中发现脊髓和DRG的全基因组DNA甲基化水平变化，表明DNA甲基化可能在持续性疼痛中起重要作用。除整体DNA甲基化水平变化外，许多研究还检测到与慢性疼痛相关的特定基因启动子区域甲基化水平增加。如神经性疼痛的啮齿动物模型与Oprm1（encoding mu 76 opioid receptor, MOR）和Kcna2（Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily A Member 2）基因启动子高甲基化相关，且与DNA甲基化在抑制基因表达中的作用一致，其蛋白水平降低。神经性疼痛用阿片类镇痛作用降低，可能是MOR表观遗传下调；Kcna2表达水平是驱动DRG神经元兴奋的重要原因。慢性疼痛中DNA甲基化水平变化并非严格单向升高，在特定启动子区域也出现低甲基化，如神经性疼痛小鼠模型的脊神经结扎（SNL）编码趋化因子受体3（CXCR3）和G蛋白偶联受体151（GPR151）的基因启动子区域甲基化水平较低。CXCR3在许多炎症条件下的病理生理过程中起关键作用，与DRG和脊髓中的疼痛调节有关。GPR151与神经性慢性疼痛中的DRG过度兴奋有关。甲基化水平变化在慢性炎症或内脏疼痛等不同形式的慢性疼痛中有不同的甲基化水平。 大鼠或小鼠足底注射完全弗氏佐剂（CFA）是持续性炎性疼痛的最佳表征和使用模型之一，可引起NGF（神经生长因子）或胱硫醚-β-合酶（CBS）基因启动子的去甲基化。DNA甲基化水平变化通过诱导或抑制DNMT表达实现，DNMT表达谱变化（双向）发生在多种疼痛状态的DRG和脊髓中。DNMT3a在慢性缩窄性损伤（CCI）和神经性疼痛的SNL啮齿动物模型中均上调。以上研究没有区分DNMT3a亚型DNMT3a2和DNMT3a1，但这两种亚型在神经系统其他区域的表达和活性模式完全不同。在小鼠海马体中，DNMT3a2表达受突触活性调控并在刺激后诱导，而DNMT3a1的水平没有变化。研究表明，慢性疼痛的相关诱导，DNMT3b表达在慢性疼痛条件下降低，且这种降低是炎症和神经性疼痛中某些基因低甲基化原因。表观遗传标记readers证据进一步支持了DNA甲基化在慢性疼痛中的重要性。大鼠CFA处理后引发炎性疼痛，脊髓背角中MeCP2被磷酸化，从而失活。此外，MBD1丢失的小鼠表现出神经性疼痛超敏反应。 （2）慢性疼痛与组蛋白修饰 甲基化也可以发生在组蛋白上。在周围神经损伤（一种神经性疼痛模型）中，损伤触发不同电压门控钾通道（voltage-gated potassium channels）下调，促进慢性疼痛中DRG神经元的过度兴奋。由于组蛋白甲基化酶G9a上调，H3K9me2组蛋白二甲基化在神经损伤后显著增加。两项啮齿动物的独立研究在功能上将G9a和H3K9me2过表达与电压门控钾通道下调相关联，G9a属于组蛋白甲基转移酶超家族，在大鼠和小鼠神经损伤后与Oprm1（编码阿片受体MOR）和大麻素受体1和2（CB1、CB2）表达变化有关，在疼痛调节中发挥重要作用，可以潜在解释大麻素或阿片类药物给药在慢性疼痛患者中往往随着时间而失效的药理学模式。此外，两种CB受体均与不同细胞类型的炎性疼痛调节相关，因此评估炎症疼痛条件下CB受体表达的表观遗传调控是非常有意义的。 除赖氨酸甲基化外，精氨酸组蛋白甲基化也与疼痛有关；精氨酸特异性去甲基化酶JMJD6（含Jumonji结构域6）的表达在神经性疼痛的大鼠模型中发生变化。 针对炎症和神经病变等不同疼痛模型描述了组蛋白乙酰化水平变化。组蛋白乙酰化受HAT和HDAC不同调控。一些研究采用不同的HDAC抑制剂来促进啮齿动物模型的镇痛，但由于研究出现矛盾的结果，无法根据这些研究描述一个清晰的机制情景。某些情况下药物HDAC抑制改善了超敏反应，而在另一些情况下则使其恶化。有可能这些差异归因于使用的HDAC抑制剂非特异性，决定性方法是针对不同HDAC，同时考虑其不同的激活模式。从这个角度来看，锥体神经元中II a类HDAC的HDAC4、5、7、9从细胞出核，将在刺激后失活。近期研究表明小鼠脊髓神经元的慢性炎性疼痛CFA模型中，伤害感受特异性地仅触发HDAC4从背角神经元细胞出核。当抑制HDAC4出核时，超敏反应也受到抑制，而急性疼痛则不受影响。慢性炎性疼痛中脊髓背侧HDAC4调控基因表达的下一代RNA测序，鉴定出一种新的中枢致敏介质——有机阴离子转运蛋白1（OAT1），初级感觉神经元中条件性敲除HDAC4主要调节热超敏反应。因此HDAC4在慢性疼痛中起关键作用，可能在取决于区域的调节敏感性方面具有双重功能。未来的比较研究有望阐明HDAC4参与慢性疼痛可能通过抑制或诱导的基因、细胞类型和条件的特异性。组蛋白乙酰化readers与慢性疼痛之间联系的证据较少，可能在不久后的新研究中有新发现。 （3）慢性疼痛与ncRNA miRNA是ncRNA中疼痛研究中最多的一组，越来越多的研究文章揭示了它们在不同疼痛状态下的调控和靶点，包括不同的神经性疼痛、炎性疼痛或癌症疼痛模型。miRNA在多个层面上与慢性疼痛的不适应性变化有关：从初传递到DRG、脊髓和皮质区域。总体而言， miRNA在不同的疼痛模型中受调控的特异性非常高，使miRNA在慢性疼痛中的影响和功能作用的工作模型开发变得复杂。特异性miRNA可能在神经性疼痛中上调，但在炎性疼痛和癌痛中不受影响，甚至出现相反的表达调控。疼痛通路的敏感性由受体和通路变化引起，最终导致过度兴奋。几种鉴定或预测的miRNA靶基因属于这一类，如靶向电压门控钙通道、电压门控钾通道及其调节亚基、电压门控钠通道的miRNA在大鼠神经性疼痛模型中发生变化。慢性疼痛的miRNA靶点也可以是关键信号元件或疼痛介质，如NGF、BDNF（脑源性神经营养因子）、NF-L（神经丝轻链）、AKT3（AKT丝氨酸/苏氨酸激酶3），同时miRNA可能影响其他表观遗传调节因子（MeCP2、Dnmt3a）。 近十年来，lncRNA在慢性疼痛中的研究领域迅速发展。从电压门控钾通道（Kv）Kcna2-AS-RNA的首次鉴定开始，lncRNA被定义为靶向神经性疼痛中Kcna2 mRNA的内源性反义转录本，在不同疼痛模型中鉴定的lncRNA与人疼痛慢性化相关。LncRNA具有不同的作用模式，可能与miRNA及其加工互作并干扰，或直接靶向参与疼痛加工的特定分子。 总结 尽管表观遗传机制在慢性疼痛中的作用已被广泛接受，一些分子和细胞机制已被阐明，但该领域仍为进一步深入研究提供了许多机会，有望促进开发新的、更精细的慢性疼痛治疗策略。 易基因科技提供全面的表观组学测序服务，有DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA甲基化测序需要的老师可联系0755-28317900。
参考文献： Mauceri D. Role of Epigenetic Mechanisms in Chronic Pain. Cells. 2022 Aug 22;11(16) pii: cells11162613. doi: 10.3390/cells11162613. PubMed PMID: 36010687. 相关阅读： |
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