文章简介
1.研究背景蛋白酪氨酸磷酸酶受体T型(PTPRT)是一种著名的磷酸酶，在黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)中经常发生突变。我们的研究「旨在阐明其突变与免疫检查点抑制剂(ICI)疗效的关系」。 我们「整合」了来自8项研究的「631份」黑色素瘤样本和来自2项研究的109份NSCLC样本的基于全外显子组测序(WES)的体细胞突变谱和临床特征。为了验证，我们使用了「321例」黑色素瘤和「350例」NSCLC免疫治疗样本进行靶向下一代测序(NGS)。此外，我们还收集了240份独立的NSCLC队列样本以进一步证实。根据PTPRT突变状态评估明显的免疫浸润。 在WES黑色素瘤队列中，PTPRT突变的患者ICI反应率显著升高(40.5% vs. 28.6%， p = 0.036)，生存结果延长(35.3 vs. 24.9个月，p = 0.006)。在WES NSCLC队列中，PTPRT突变的患者也观察到良好的反应和免疫治疗生存率(p = 0.036和0.019)。在验证队列中，在黑色素瘤、NSCLC和靶向NGS的泛癌患者中发现了「PTRPT突变与较好的预后之间的关联」(所有p<0.05)。此外，免疫学分析显示突变负担较高**,** PTPRT突变患者淋巴细胞浸润增加，基质活化减少，免疫应答通路增强。 我们的研究表明，PTPRT突变可能被认为是评估ICI对黑色素瘤和NSCLC疗效的潜在指标，甚至跨多种癌症。进一步的前瞻性验证队列是值得的。 2.研究方法「基于全外显子组测序(WES)的631例接受免疫检查点抑制剂（抗CTLA-4, 抗PD-l/PD-L1，或联合用药)的黑色素瘤患者体细胞突变数据来自于之前的8项研究，以及109例NSCLC患者来自于2项研究。」我们使用Oncotator统一重新注释本研究中策划的所有体细胞突变。非同义变更被用于分析。用于评估新抗原计数的MHC结合亲和力评分和HLA类型分别来自224份黑色素瘤和109份NSCLC样本。 「来自TCGA的457份黑色素瘤和995份NSCLC样本的基因表达、体细胞突变谱和临床特征来自Genome Data」。「在本研究中，所有的mRNA表达相关分析都是利用TCGA的基因表达数据实现的。本研究的工作流程如图1所示。」 01 破译基因组中的突变特征Kim等人提出的方法被用于检测整合黑色素瘤和NSCLC队列的突变特征。该算法的核心是**贝叶斯变式非负矩阵分解(NMF)**。具体来说，利用NMF对包含96个碱基替换类的突变画像矩阵A进行分解。矩阵A分为两个非负矩阵W和H(即A WH)，其中W表示检测到的突变签名，H表示每个对应签名的突变活动。矩阵A的列是检测到的代表96种碱基替换类型的签名和行数。所有提取的突变签名随后都用基于余弦相似度存储在COSMIC数据库(版本2)的30个精心管理的特征进行注释。 02 评估免疫细胞浸润（两种方法）采用CIBERSORT算法根据LM22特征推断22种免疫细胞类型的肿瘤浸润比例。Angelova等人建立了一个免疫固有基因标记来推断31种不同的免疫细胞浸润和肿瘤免疫景观，两种方法均获得全面的免疫浸润结果。 03 基于微环境的免疫相关信号特征先前报道的免疫相关信号收集如下:(1)免疫和基质细胞信号，分别反映微环境中总的免疫和基质细胞浸润水平; (2)免疫细胞亚群，T细胞、B细胞、NK细胞富集;(3) T/NK、B/P、M/D突变基因，分别表示T/NK细胞、B/浆细胞、单核细胞/树突状细胞活性;(4) 1/2型干扰素反应，这是两种不同的干扰素反应类型，分别由干扰素α和γ作用;等 04 基质被激活的标志Moffitt等人报道了一个「基质相关的特征」，由两种不同的特征(即激活基质和正常基质)定义。基于具有不同特征基因亚群的最近邻模板预测算法(NTP) ，可以识别出激活的基质亚型。(2)免疫细胞亚群，T细胞富集，B细胞和NK细胞；(3) T/NK、B/P、M/D metagene，分别指示T/NK细胞、B/浆细胞、单核细胞/树突状细胞活性；(4) 1/2型IFN反应，这是两种不同的干扰素反应类型，分别由干扰素α和γ4发挥作用。 05 GSEA与GSVA应用GSVA软件包中的单样本基因集富集分析(ssGSEA)方法，基于特定特征基因推断每个样本所有策划的免疫签名的富集分数。利用R包DESeq2进行PTPRT突变状态基因表达谱差异分析。将差异结果提取的t值用于fgsea软件包进行基因集富集分析( GSEA)。标记基因集和分子标记数据库(MSigDB)中注释较好的通路「作为背景信号」。「错误发现率(FDR)和归一化富集评分(NES)基于100万种排列得到」。 06 PTPRT突变与突变负担的关系基因组不稳定性总是受到基因组维持调控因子改变的影响。因此，我们对基因组维持基因(即基因组维持基因)的突变进行多变量逻辑回归模型（如BRCA1/2, TP53和POLE），并检测到突变特征，考虑PTPRT突变和突变负担之间的调整关联。在我们的研究中，在WES和TCGA队列中，TMB被计算为每兆酶总非同义突变的log2转化;对于目标人群，TMB从补充文件中获得。根据Balachandran等人提供的一种最新方法「评估」了224例黑色素瘤和109例NSCLC WES样本的**新抗原负担(NB)**。从TCGA队列中下载了340例黑色素瘤和656例NSCLC样本的新抗原数据。 3.研究结果01「黑色素瘤和NSCLC样本收集和研究设计」首先作者利用了WES测序与468个基因的靶向测序，探究了PTPRT突变分别对于结合免疫治疗的NSCLC与Melanoma的影响，KM生存分析曲线表明突变有利于生存。接着，作者进一步分析了突变与不突变之间的突变负荷，并整合了TCGA表达谱数据，看PTPRT突变与否，免疫细胞类型发生的变化以及具体通路发生的变化。 02 「破译基因组中的突变特征」在来自8项WES免疫治疗研究的631份黑色素瘤样本中，有193例(30.6%)被认为是「ICI治疗应答者」。这个综合黑色素瘤队列「主要由C>T突变」(图2)。图中也显示了PTP家族成员和基因组完整性维护基因(例如:与PTPRT突变相关的BRCA1、BRCA2、TP53和POLE)的突变情况。我们观察到PTPRT是「PTP家族中最常见的突变基因」，在631份黑色素瘤样本中占126份(20.0%)。PTPRT突变的「详细氨基酸变化可以看看补充图1中的棒棒糖图」。 左图显示基因名称，上图显示每个样本的「非同义突变计数」，「中间图显示不同突变类型的纳入基因的突变模式」，右图显示每个基因的「突变率」，底部图显示「免疫治疗反应状态、临床特征和碱基替代分类。」 03 「PTPRT突变可预测黑色素瘤免疫治疗的结果和反应」结果显示，与未发生PTPRT突变的患者相比，PTPRT突变患者的ICI「预后明显延长」(图3A)。在「多因素Cox回归分析中」，当控制年龄、性别、分期和治疗类型时，这种联系仍然存在，表明PTPRT突变可以作为一个「独立的预后因子（图3B）」。计算PTPRT突变「在个体队列和不同治疗类型中的预后能力」，我们观察到「PTPRT突变也与免疫治疗应答率升高有关（」图3C）。考虑临床混杂因素进行多因素cox模型，结果仍达到统计学意义，表明PTPRT突变与免疫应答率的升高是「独立的关系（图3D）」。 (A)不同PTPRT状态的Kaplan Meier曲线。(B)考虑到临床混杂因素，PTPRT突变与ICI预后之间的联系的森林图表示。(C) Fisher精确检验和(D) PTPRT突变与ICI反应率的多变量逻辑回归模型评估 04 「PTPRT突变与黑色素瘤的突变负担」PTPRT突变的黑色素瘤患者TMB和NB显著升高（图4A-4B）。由于特定的突变特征在基因组中起作用，可能导致基因组不稳定和变异突变率。通过使用COSMIC注释，我们从汇集的黑色素瘤队列中提取了4个突变特征;它们是年龄相关特征1、吸烟相关特征4、紫外线照射诱导特征7和烷基化剂处理诱导特征11。提取的黑色素瘤队列的详细突变活性可见附表。「为了消除PTPRT突变与TMB之间的联系受其它黑色素瘤因素影响的可能性」，我们将临床因素、检测到的特征(即1、4、7和11)以及BRCA1/2、TP53和POLE突变纳入「多因素逻辑分析」。经调整分析后，「PTPRT突变与TMB的相关性仍然显著」（图4C）。「基于TCGA队列」的黑色素瘤样本，「PTPRT突变伴TMB和NB升高的结果也一致」(图4 D-4E)。 (A) TMB和(B) NB在合并黑色素瘤WES队列中不同PTPRT亚组中的分布。(C) PTPRT突变和TMB之间的多变量回归模型与临床特征、提取的突变特征以及考虑基因组修复基因突变来调整混杂因素。(D) TMB和(E) NB在TCGA黑色素瘤队列中不同PTPRT亚组中的分布 05 「在WES NSCLC队列中，PTPRT突变与ICI疗效和突变负担相关」分析完了黑色素瘤，作者对NSCLC进行了分析。在109例精心筛选的NSCLC WES样本中，有36例(33.0%)「被评估为免疫治疗应答者」。PTPRT在NSCLC中也经常发生突变，109例患者中有12例(11.0%)。通过KM生存分析，我们证明PTPRT突变的NSCLC患者比野生型患者具有更好的ICI生存结局（图5A)。为了验证PTPRT对NSCLC预后的独立性，作者纳入了多个变量通过「多因素cox」进行了验证（图5B）。计算PTPRT突变「在个体队列和不同治疗类型中的预后能力」，我们观察到「PTPRT突变也与免疫治疗应答率升高有关」（图5C);即使对「多个混杂因素进行了调整」，该联系仍然显著(图5D)。 (A)不同PTPRT状态的Kaplan Meier曲线。(B)考虑到临床混杂因素，PTPRT突变与ICI预后之间的联系的森林图表示。(C) Fisher精确检验和(D) PTPRT突变与ICI反应率的多变量逻辑回归模型评估。 06 「PTPRT突变与NSCLC的突变负担」此分析方式同04的PTPRT突变与黑色素瘤的突变负荷。图6A与图6B表明PTPRT突变的NSCLC患者TMB与NB显著上升。「为了消除PTPRT突变与TMB之间的联系受其它NSCLC因素影响的可能性」，作者同样将临床因素、检测到的特征(即「1、4与7」)以及BRCA1/2、TP53和POLE突变纳入「多因素逻辑分析，」经调整分析后，「PTPRT突变与TMB的相关性仍然显著」（图6C）。「基于TCGA队列」的NSCLC样本，「PTPRT突变伴TMB和NB升高的结果也一致」(图6D-6E)。 (A-B) 合并NSCLC WES队列中TMB和NB在不同PTPRT亚组中的分布。(C) PTPRT突变和TMB之间的多变量回归模型与临床特征、提取的突变特征以及考虑基因组修复基因突变来调整混杂因素。(D-E) TMB和NB在TCGA NSCLC队列中不同PTPRT亚组中的分布 07 「有靶向NGS的黑色素瘤和NSCLC患者的确证」为了验证PTPRT突变的免疫治疗意义，我们采用了1661例经ICI治疗的具有靶向NGS的「泛癌患者」。「生存分析显示，PTPRT突变与多种癌症的良好生存结果相关（图7A）。」在调整了年龄、性别、治疗类型、转移状态和癌症类型后，作者通过「多因素cox回归」表明这一联系仍然具有统计学意义「（图7B）」。「随后，我们评估了PRPRT突变与来自该」靶向肿瘤队列的黑色素瘤和NSCLC患者预后的关系「。与上述结果一致，生存曲线结果表明PTPRT突变的黑色素瘤患者」具有明显较好的ICI预后相较于没有突变的（图7C），多因素Cox回归分析证明了其独立性（图7D）**。对于NSCLC, PTPRT突变组在两种单因素中均观察到轻微显著更好的预后(图7E)和多因素分析验证结果(图7F)。PTPRT突变的TMB升高也在泛癌、黑色素瘤和NSCLC队列中观察到（图7G-7I)**。 (A-B)不同PTPRT组和调整森林图的Kaplan Meier生存曲线分别显示在泛癌、(C, D)黑色素瘤和(E, F) NSCLC样本中，PTPRT突变与预后的关系。箱线图图显示了PTPRT突变和TMB在(G)泛癌、(H)黑色素瘤和(I) NSCLC样本中的联系。 08 「在一个有靶向NGS的独立NSCLC队列中进一步证实」在Rizvi等人的研究中，我们获得了「240例NSCLC样本」，他们接受了「靶向测序和ICI治疗」。我们进一步验证了PTPRT突变「在这个独立队列中的预后作用」。正如预期的那样，PTPRT突变与良好的ICI生存有关（图8A），这种关联经过多因素校正模型分析表明依旧存在（图8B）。此外，通过Fisher精确检验，PTPRT突变患者的「免疫治疗应答率」也增加(图8C)，多因素logistic回归模型也进行了验证表明突变与免疫治疗应答率「相关的独立性」(图8D)。 (A)不同PTPRT状态的Kaplan Meier曲线。(B)考虑到临床混杂因素，PTPRT突变与ICI预后之间的联系的森林图表示。(C) Fisher精确检验和(D) PTPRT突变与ICI反应率的多变量逻辑回归模型评估 09 「与PTPRT突变相关的免疫细胞浸润、免疫相关特征和通路」考虑到PTPRT突变在免疫治疗预后评估中的关键作用，我们「探索了黑色素瘤PTPRT突变背后的潜在机制」。免疫细胞分析显示，免疫应答细胞(激活CD4和CD8 T细胞、效应记忆CD4 T细胞和M1巨噬细胞)「浸润较多」，免疫抑制细胞（如调节性T细胞）「浸润较少」与PTPRT突变相关。此外，我们还观察到「肥大细胞丰度降低」(图9B)，之前被发现是一种免疫抑制剂。基因表达谱ssGSEA分析表明，在「14种免疫信号中」，基质细胞信号富集与PTPRT突变呈负相关(图9C)。同时，PTPRT突变组中具有免疫抑制作用的激活基质比例降低(图9D)。GSEA通路分析结果表明，两种干扰素介导的免疫信号，包括IFNα和IFNγ反应，都在PTPRT突变患者的顶部环路中显著「富集」(图9 E-9F)。众所周知，「促进肿瘤免疫逃逸的EMT通路」在PTPRT突变组中「显著缺失」(图9G)。 (A-B) 分别用CIBERSORT和 Angelova等方法「计算不同免疫浸润细胞的丰度」。两个亚组间「差异显著的免疫细胞浸润用蓝色标记」。(C) Heatmap显示了PTPRT突变与野生型患者免疫相关标记的富集分数。两个亚组之间「显著差异富集的免疫信号用红色标记」。(D)活化间质亚型在PTPRT突变型与野生型患者中的分布比例明显不同。(E-F)在PTPRT突变组中「富集免疫相关通路」，如干扰素α和干扰素γ反应。(G) PTPRT野生型组中免疫「抑制EMT信号通路的富集」。 4.研究结论总之，在这项综合研究中，PTPRT突变被确定为一个推定的强生物标志物，可以推断黑色素瘤、NSCLC，甚至多种癌症中基于免疫检查点的治疗反应。「在不同癌症类型和测序平台的相互验证下」获得了相关结果。「需要进一步的前瞻性验证队列和机制研究」。 |
|
|
「图1：文章工作流程图 ：」在不同测序方法的黑色素瘤和NSCLC样本中，PTPRT突变与免疫检查点抑制剂疗效和免疫相关因素的关联的图形抽象展示。 ICI免疫检查点疗效。
「图二：瀑布图表示PTPRT的突变模式，其家族成员和基因组完整性保持基因。」
「图3 PTPRT突变预测聚集性黑色素瘤WES队列中的ICI疗效」
「图4黑色素瘤中PTPRT突变与突变负担相关」
「图5 PTPRT突变预测合并的NSCLC WES队列的ICI疗效」
「图6 NSCLC中PTPRT突变与突变负担相关」
「图7」 「通过靶向NGS队列验证PTPRT突变与较好的ICI预后和TMB升高之间的联系」
「图8：用一个独立的靶向NSCLC队列进一步证实」
「图9」 「黑色素瘤PTPRT突变的免疫学分析」
