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作者：姚感，南京农业大学博士在读，主要研究链霉菌代谢产物对植物根系微环境的影响。 周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍植物免疫机制的进化论，原文于2022年发表在《PNAS》上。
链霉菌拥有一个与其出色的代谢功能密切相关的复杂生命周期。探索涉及细菌在固体表面上快速扩张结构化群落。营养物质的可用性影响探索动力学，作者发现甘油可以显著提高探索率，并改变探索群落的代谢产物。甘油介导的生长加速伴随着不同的转录标记和激活隐藏的代谢物，包括橙色素卟啉、氯霉素和不常见的铁载体——甲氧嘧啶（foroxymithine）。已知探索培养物还可以产生广为人知的胞外金属载体去铁胺。对单个和双重铁载体突变体的突变研究揭示了当细菌菌株在自身培养条件下时的功能冗余性；当与酿酒酵母共同培养时，甲氧嘧啶的缺失比去铁胺的缺失更严重，导致生长劣化。同时这两种铁载体显示出不同的定位模式，甲氧嘧啶扩散到了菌落边缘之外，而去铁胺则仅限于菌落区域内。当酿酒酵母的铁载体窃取能力被敲除时(酿酒酵母编码去铁胺特异性转运体)，去铁胺带来的相对适合度优势就消失了。研究表明，探索的链霉菌群落可以参与以营养物为目标的代谢竞争，利用铁载体可以在共同培养时成功地与其他微生物竞争有限的铁资源。YPG和YP条件下转录谱明显不同。 委内瑞拉链霉菌在含有甘油的平板(YPG，酵母提取物-蛋白胨-甘油)上的探索与在标准条件(YP，酵母提取物-蛋白胨)探索上的生长相比有明显的表型差异 (图1A)。当比较从YPG早期和晚期时间点的转录本时，在全基因组范围内观察到基因表达的差异(图1B)。当比较相同的后期探索时间点时， YP和YPG之间的转录谱存在显著差异(图1C)。这些结果表明，对YP和YPG的探索可能具有不同的遗传驱动因素。伴随YPG生长的强色素沉着(图1A)促使作者研究在这些生长条件下，指导特殊代谢物产生的基因是否被上调。作者发现在YPG的生长过程中，有两个簇被显著上调:氯霉素生物合成簇和含有非核糖体肽合成酶(NRPS)基因的簇(图1D)。
图1 在甘油(YPG)上的基因表达与在YP上的基因表达有显著差异 (A)委内瑞拉链霉菌培养物在YP或YPG培养基上探索的表型。(B) YPG早期和晚期的基因表达差异。(C) YP和YPG RNA测序数据集的早期和晚期时间点之间存在。(D) YP和YPG在探索后期时间点之间的差异基因表达。氯霉素的生物合成基因簇和含有NRPS的基因簇用蓝色和黑色框起。 YPG条件下可以产生特殊代谢物，并影响其他微生物的生长委内瑞拉链霉菌在YP代谢物的对革兰氏阳性指示生物滕黄微球菌的抗生素活性可以忽略不计，YPG代谢物则产生了强抑菌效果(图2A)。由于其中一个上调的基因簇指导氯霉素的合成，作者利用了一个缺乏氯霉素生产的突变体(ΔcmlR)，但发现野生型和突变株对滕黄微球菌的生长抑制相同，这表明另一种抗生素存在(图2A)。而之前构建的ΔNRPS突变体与野生株相比，该菌株的条件培养基几乎没有抗生素活性。随后构建一个双突变菌株(ΔcmlR-ΔNRPS)，发现抗生素活性完全消失。为了验证YPG培养的探索培养物产生了两种不同的生物活性化合物，作者比较了野生型和两种突变菌株的代谢物提取物谱(图2B)。在ΔcmlR突变株中，后期洗脱的活性组分丢失，因此预计含有氯霉素，ΔcmlR-ΔNRPS突变体的任何部分均未观察到活性 (图2B)。使用antiSMASH对含有NRPS基因簇(图2C)分析，发现其与羟酸铁分子salinichelin生物合成基因高度相似。通过比较不同突变体(ΔcmlR，ΔNRPS和ΔcmlR-ΔNRPS)在向生长培养基中添加额外的铁时抑制滕黄微球菌生长的能力(图2A)。在野生型和氯霉素突变体的条件培养下，铁补充有效回补了滕黄微球菌的生长，并使用CAS检测检测这种代谢物(图2A)。通过LC-MS分析含有活性铁载体组分和ΔNRPS菌株中分离的等效组分，特有物质m/z为576.26，向样品中添加过量的FeCl3在435 nm处出现一个具有强紫外吸收的新峰，相应物质m/z为629.17 (图2D)。将LC-MS数据与antiSMASH分析结合，NRPS簇中编码的额外剪裁酶 (图2C)，以及对salinichelin生物合成途径的理解，作者为NRPS铁载体生成了一个预测的化学结构(图2E)。
图2委内瑞拉链霉菌的抗生素活性是由于隐藏的铁载体活性 (A)委内瑞拉链霉菌菌株中提取物对滕黄微球菌的抗生素活性测试（上）;补充100 μM FeCl3抗菌活性(中);CAS铁载体活性(下图)。(B)分离所示菌株的代谢物提取物的抗生素活性。(C)(上)foroxymithine (fxm) NRPS生物合成簇。(D)上:m/z为576.26的离子的质谱检测器分离的总离子色谱图。下:关联峰的MS/MS碎片数据。（E)假设的铁载体的化学结构。虚线箭头表示在实验数据(D)中观察到的产生m/z值的理论分子离子片段。 实验构建双铁载体突变体(ΔNRPS-ΔdesABCD：去铁胺缺失突变)。在YP条件，两种单一的铁载体突变体在菌落扩张和发育速度上都有降低，双突变体表现出明显的缺陷，菌落要小得多，无野生型特有的褶皱核心结构(图3A)。但在YPG上，所有铁载体突变体都表现出相对较小的探索缺陷(图3A)。同时CAS试验中观察到的铁封存模式差异(图2A)。产生甲氧嘧啶的菌株(野生型和ΔdesABCD)始终在菌落边界之外很好捕获铁(图3b和C)。相反，只产生去铁胺的菌株(ΔNRPS)只在菌落区域内捕获铁，而缺乏这两种铁载体的菌株则具有最低的铁摄取能力(图3b和C)。这表明，对甲氧嘧啶具有独特的能够扩散到菌落边界之外的能力。这一观察结果与预测的甲氧嘧啶相对于去铁胺更大的相对亲水性相一致。
图3 铁载体活性的空间分布。 (A)野生型委内瑞拉链霉菌在YP和YPG上与单、双铁载体突变体。(B)野生型和单/双铁载体突变菌株在YPG上生长5 d(顶部)，并确定菌落面积。用CAS琼脂盘复盖培养皿和菌落3 h。(C)图中(A)和(B)所示菌株的粉色/铁螯合面积与菌落面积之比。 当与酿酒酵母接种时，双铁载体缺失突变体完全无法生长，并且NRPS突变株与野生型和去铁胺突变株相比，表现出明显的生长延迟(图4a和B)。在YPD生长培养基中补充了100 μM铁(图4a和B)，或从野生型或desABCD突变菌株中提取的YPG条件提取物(图4C)时，这些可以恢复至野生型水平。相比之下，NRPS突变株的条件提取物只能部分恢复生长，双突变株和培养基单独对照的提取物在与酵母共培养时都不能促进双突变株的生长(图4C)。
图4 隐铁载体活性对与酵母竞争生长至关重要。 (A)将野生型以及单、双铁载体突变体与酵母酿酒酵母混合，后在补铁和不补铁的情况下接种至YPD。(B)为野生型和铁载体突变体制备固体培养基生长曲线(实线)和不补充铁(虚线)。(C) YPG培养基由具有不同铁载体生产能力的探索委内瑞拉链霉菌菌株调节。生长7 d后，从条件培养基中提取代谢物，与无条件培养基对照一起，随后用于补充固体YPD。将野生型酿酒酵母与野生型委内瑞拉链霉菌(上)或双铁载体突变体 (下)的标准化共培养物与未补充的YPD对照一起标记到提取物补充板上，并进行评分以进行探索。 酿酒酵母不产生铁载体，但它编码的转运蛋白Sit1可以吸收铁胺。当与酵母竞争生长时，委内瑞拉链霉菌产生的去铁胺可能会被酿酒酵母窃取，而甲氧嘧啶可能会抵抗酵母的摄取。为了验证这一点，作者比较了委内瑞拉链霉菌铁载体突变体与野生型酵母或Δsit1菌株一起生长时的菌落扩张率(图5)。重要的是，不再观察到与NRPS缺失相关的显著生长缺陷 (图5)，这表明当铁载体竞争被移除时，该化合物的重要性降低了。这些结果表明，对铁获取的需求可能会促进微生物军备竞赛，在竞争中生存需要其他营养获取策略。
图5 酵母的去铁胺特异性转运体的存在影响探索速度。 (A)在野生型酿酒酵母或Δsit1突变菌株存在下，委内瑞拉链霉菌铁载体突变体的代表性图像。生长12 d后拍照。(B)委内瑞拉链霉菌野生型和去铁胺突变体与野生型酿酒酵母的菌落表面积测量曲线。(C)用Δsit1酿酒酵母检测委内瑞拉链霉菌野生型和铁载体突变体菌落表面积的生长曲线。 作者在这里的工作表明，不同的探索性生长模式与独特的专门代谢特征有关。对于生长在YPG上的委内瑞拉链霉菌来说，这些代谢物相对于YP上的经典发育或探索性生长具有显著的竞争优势，具有更高的抗生素活性，增强了铁获取和营养调节能力。除了通过产生转录沉默的铁载体来扩大其在YPG生长期间的铁捕获策略外，委内瑞拉似乎还利用其多种铁载体的差异分布作为多层铁封存方法的一部分。甲氧嘧啶很容易从其产生菌落中扩散出去，有效地将铁隔离在生长菌落边缘之外(以及菌落区域内)，并抑制邻近微生物的生长。最后，去铁胺的作用似乎主要是确保菌落边界内的铁(图6)。当委内瑞拉链霉菌与竞争微生物一起生长时，尤其是与那些有能力吸收(但不产生)铁胺铁载体的微生物一起生长时，这种为其生产者结合和储备铁的能力似乎是最关键的。这表明当感知到附近的微生物竞争对手时，委内瑞拉链霉菌可能会激活铁载体的生产，而这些铁载体的专用转运体分布不太广泛(例如甲氧嘧啶)，以确保更单向地恢复其他共同利益，这可以解释为什么许多细菌编码多个铁载体。
图6 影响链霉菌探索和与其他微生物竞争的营养和代谢因素概述。 酵母菌可以产生甘油，这可以加速链霉菌的探索。链霉菌对这些低铁条件的反应是释放铁载体(和铁结合时的再摄取)，包括去铁胺和甲氧嘧啶。去铁胺的释放仅限于探索菌落区域，但也可以通过酵母的Sit1转运蛋白被酵母吸收。甲氧嘧啶的释放超出了群落区域，并进一步减少了其他生物可利用的铁量。这个缺铁区最终会抑制其他生物的生长，以及由探索菌落释放的其他抗生素，如氯霉素。论文信息 原名：Cryptic specialized metabolites drive Streptomyces exploration and provide a competitive advantage during growth with other microbes 译名：神秘的专业代谢物推动链霉菌探索并在与其他微生物共生时提供竞争优势 期刊：PNAS DOI：10.1073/pnas.2211052119 发表时间：2022 通讯作者：Marie A. Elliot 通讯作者单位：哈佛大学
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