|
1.避免污染 为避免RNase/DNase等污染，可以在操作前仔细清洁实验平台、试剂盒、器皿和工具等，并使用经RNase/DNase清洗的试剂和器皿。此外，应该尽可能快地进行样品提取，以减少RNA/DNA降解和污染的可能性。 2.明确目的和选择合适的方法 RNA和DNA在分子结构和物理化学特性上有所不同，并且不同的样本类型也有不同的组织结构和特征，因此需要根据实验目的和样本类型选择合适的RNA/DNA提取方法。例如，在提取RNA时，需要更加注意RNase的污染问题；而在提取DNA时，则需要更加注意DNA的不断降解问题。 3.优化样品破碎步骤 样品破碎对RNA/DNA提取至关重要。不同样品类型需要不同的破碎方法，如高压均质机、超声波等。在破碎过程中，需要注意破碎时间和功率控制，以避免过度破碎导致RNA/DNA的降解。 细胞破碎方法：超声波法、高压均质法、玻璃珠法等都是常用的细胞破碎方法。 4.RNA/DNA的纯化和浓缩 在提取和纯化RNA/DNA过程中，需要去除可能存在的污染物，如蛋白质、盐等，并尽可能地减少DNA和RNA的降解。此外，在进行RNA/DNA浓缩时，应根据实验要求选择合适的方法，如酚/氯仿法或柱层析法等。 5.对提取的RNA/DNA进行检测和评估 在提取RNA/DNA之后，需要对其进行确定性和质量评估。可以使用分光光度计和凝胶电泳等技术来测定RNA/DNA的浓度和质量，并评估是否存在RNase/DNase污染等问题。 6.RNase/DNase污染： RNase或DNase的污染很容易导致RNA/DNA降解，因此需要使用经RNase/DNase清洗的器皿和试剂，并在操作中避免污染。 7.温度控制： RNA/DNA在高温下易于分解，因此在提取RNA/DNA时要控制好温度。在冷冻样品之前，通常建议在低温环境中培养细胞或收集组织，以最大程度地保护RNA/DNA。 8.RNA/DNA保存： RNA/DNA应该储存在-80℃冰箱中，以避免降解和污染。在长期储存之前，建议进行浓缩，并将RNA/DNA用RNase-free水稀释至合适的浓度。 9.质检： 在提取RNA/DNA之后，需要对其进行确定性和质量评估。可以使用分光光度计来测定RNA/DNA的浓度和质量，或者使用凝胶电泳来确认RNA/DNA的大小和纯度. 1.RNA/DNA浓度低： 如果提取得到的RNA/DNA浓度较低，则可以通过浓缩RNA/DNA溶液或在提取过程中增加样品量来提高RNA/DNA的浓度。 2.RNA/DNA质量不佳： 如果RNA/DNA分离后质量不佳，则可能是由于RNase/DNase污染、过度破碎、过度处理等原因导致的。需要仔细检查每个步骤，并采取相应的措施来避免这些问题。 3.提取RNA或DNA有选择性： 有时，RNA或DNA的提取会出现选择性问题，即只能提取其中一种。这通常是由于使用的试剂或条件不适合同时提取RNA和DNA所导致的。可以尝试更换试剂或优化条件，以获得更好的RNA/DNA提取结果。 4.样品残留： 在提取RNA/DNA时，倒掉废液后可能会有样品残留在管子或器皿中。这可能会导致RNA/DNA的污染和降解，因此需要特别小心地清洁所有器皿和工具，确保没有任何残留物。 总之，在进行RNA/DNA提取时需要注意许多方面，并且可能会遇到一些问题。如果出现问题，需要仔细检查每个步骤并逐步解决问题，以确保最终得到高质量的RNA/DNA样本。 1.动物组织DNA提取准备 ① 材料：动物组织 ② 试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等 ③ 设备：离心机，微量移液器等 2.动物组织DNA提取步骤 ① 处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 ② 加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。 ③ 加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。（溶解DNA） 注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。 ④ 加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（沉淀DNA） ⑤ 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（吸附沉淀） ⑥ 向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 ⑦ 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 ⑧ 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（～13,400×g）离心30s，倒掉废液。（6、7、8为漂洗） ⑨ 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR等实验） ⑩ 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。（溶解洗脱DNA）（注意：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低） 洗脱缓冲液体积不应该少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm（～13,400×g）离心2min。DNA产物应保存在-20℃，以防止DNA降解。 1.植物组织DNA提取仪器与设计准备 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸 （EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 2.植物组织DNA提取步骤 植物组织的DNA提取通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 详细操作步骤如下： ① SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 ② 将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 ③ 加入700ml的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 ④ 置于65℃的水浴中，每隔10min轻轻摇动，30min后取出。 ⑤ 加入200mlKAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30min。 ⑥ 10000rpm离心5min，上清移至新离心管中，12000rpm离心5min。 ⑦ 上清移至新离心管中，加入700ml异丙醇，-20℃冰箱30min。 ⑧ 10000rpm离心5min，弃上清，加入500ml70%乙醇漂洗。 ⑨ 弃液体，晾干。 ⑩ DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280»1.8：说明较纯； OD260/OD280>1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280<1.8：说明可能有蛋白质污染。 3.植物组织DNA提取注意 ① 叶片磨得越细越好。 ② 注意移液器的正确使用。 ③ 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 4.RNA提取注意事项 ① 组织样本要尽可能的新鲜，避免反复冻融。 ② 提取时组织要充分研磨，组织量不宜过少，更不宜过多。 ③ 加入裂解液后应给予充分的孵育时间，使样本充分裂解。 ④ 在用Trizol法提取时，分层后吸取上清的原则是“宁愿少吸，不能多吸”，千万不能提取到中间层，否则会导致严重的基因组DNA污染。 ⑤ 洗涤时洗涤液应充分浸润到管壁的四周，确保洗涤彻底。 ⑥ 柱式提取法，洗涤完后除了对柱子进行空离后，还应当将吸附柱置于超净台内吹风5~10 min，使有机溶剂充分挥发干。 ⑦ 柱式法最后洗脱时候，当加入DEPC水后还应孵育3~5 min，或者提前将DEPC水加热至60℃，可提高洗脱得率。传统的Trizol裂解异丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀，则应当给予适当溶解时间，并用枪头不断吹吸离心管底部。 1.获得RNA效率低有一下原因 ① 样品裂解或匀浆处理不彻底 ② 最后得到地RNA沉淀未完全溶解 2.A260/A280＜1.65原因 ① 检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高 ② 样品匀浆时加地试剂量太少 ③ 匀浆后样品未在室温放置2分钟 ④ 水相中混有有机相 ⑤ 最后得到地RNA沉淀未完全溶解 3.RNA降解原因 ① 组织取出后没有马上处理或冷冻 ② 样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存 ③ 细胞在胰酶处理时被破坏 ④ 溶液或离心管未经RBase去处理 4.预防RNase污染，应注意以下几个方面 ① 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。 ② 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。 ③ RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 ④ 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。 关注公众号，了解更多！ 👇
点击“阅读原文”了解更多 |
|
|
