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1.APOE表达定义了人类乳腺癌中的肿瘤相关巨噬细胞为了明确识别乳腺肿瘤内的肿瘤相关巨噬细胞，作者试图定义特定的特征，以便将其与浸润的CD14 + CD1c − 单核细胞、CD14 + CD1c + 炎性树突状细胞/DC3或CD14 − CD1c + cDC2区分开来。首先，作者对一组未经治疗的激素受体阳性乳腺癌患者的原发肿瘤和转移淋巴结中的单核细胞进行了定量分析。作者发现，与非转移淋巴结相比，CD1c − CD14 + 单核细胞/巨噬细胞在转移淋巴结中显著增加。CD14 + 细胞浸润与淋巴结中肿瘤侵袭程度相关。接下来，作者试图以无偏的方式表征整个肿瘤浸润的CD14 + 细胞的异质性。为此，作者通过FACS分选CD11c + HLA-DR + 细胞，从未经治疗的激素受体阳性乳腺癌患者的转移淋巴结、原发肿瘤和血液中分离出单核细胞，并进行了单细胞RNA测序。作者使用SEURAT流程处理数据，并合并了来自所有患者的约18,000个髓系细胞。Louvain基于图的聚类识别出4个单核吞噬细胞簇以及循环细胞和“压力”细胞的群体。簇0的特征是选择性地表达定义CD14 + CD16 − 单核细胞的标记物。簇1的特征是定义CD1c + 树突状细胞的基因，而簇4被鉴定为CD14 − CD16 + 单核细胞。簇2被鉴定为肿瘤相关巨噬细胞，因为它选择性地表达了TAM标志物的高水平。簇2表达了高水平的APOE、APOC1、C1QA和C1QC，使其与单核细胞区分开来。作者展示了APOE的均一表达可以选择性地区分TAMs和CD14 + 单核细胞以及CD1c + 树突状细胞。其他常用的标记物无法实现这种区分。作者接下来验证了在CD1c − CD14 + 细胞中区分巨噬细胞/肿瘤相关巨噬细胞和单核细胞的蛋白表达。使用APOE和CCR2染色得到了最佳的单核细胞/巨噬细胞鉴定结果。作者分析了CCR2 + 单核细胞和APOE + 巨噬细胞在乳腺癌腔内病变和无肿瘤组织中的贡献。作者发现，APOE + 巨噬细胞的频率随肿瘤负担增加而增加，而CCR2 + 单核细胞的频率则减少。最后，作者发现APOE + 细胞位于转移性淋巴结和原发肿瘤的病变附近和内部。总的来说，作者的结果确定了APOE作为乳腺癌原发肿瘤和转移性淋巴结中巨噬细胞的特异性标记物。
2.单细胞RNA测序揭示了APOE巨噬细胞的两个亚群作者接下来试图通过前瞻性分离这些细胞群体进行大规模转录组分析来验证这一发现。作者寻找在这两个细胞群体之间表达差异的表面蛋白。作者在组织解离后未能检测到TAMs细胞表面的TREM2。相反，作者发现c1特异性地表达并染色阳性CADM1。流式细胞术分析显示FOLR2和CADM1的表达呈互斥模式，存在于CD11c + HLADR + XCR1 − CD1c − CCR2 − CD14 + 巨噬细胞群体中。作者通过FACS分选从原发肿瘤和转移性淋巴结中分离出FOLR2 + CADM1 − 和FOLR2 low CADM1 + 巨噬细胞。FOLR2 + CADM1 − 巨噬细胞呈典型的巨噬细胞形态，并充满液泡。相比之下，FOLR2 low CADM1 + 巨噬细胞体积较小，形态更接近单核细胞。作者接下来对FOLR2 + CADM1 − 巨噬细胞、FOLR2 low CADM1 + 巨噬细胞以及CD14 + CCR2 + 单核细胞进行了批量RNA测序。层次聚类显示，原发肿瘤和转移淋巴结中的FOLR2 + CADM1 − 巨噬细胞与FOLR2 low CADM1 + 巨噬细胞或CD14 + CCR2 + 单核细胞聚集在一起。作者证实了单细胞RNA测序结果，表明从转移淋巴结或原发肿瘤中分离的FOLR2 + 巨噬细胞与FOLR2 low CADM1 + 巨噬细胞和CD14 + CCR2 + 单核细胞相比，表达了更高水平的FOLR2、SEPP1、SLC40A1和LYVE1。原发肿瘤中的FOLR2 low CADM1 + 巨噬细胞与CD14 + CCR2 + 单核细胞聚集在一起，但特异地表达了TREM2和在单细胞RNA测序分析中发现过表达的c1基因。其中一些表型差异通过对转移性淋巴结中CD14 + CCR2 − 巨噬细胞的CyTOF分析得到确认。LYVE1、MRC1/CD206和CD163的共表达在一个与CADM1 + 巨噬细胞表达不同的巨噬细胞群体中被发现。总的来说，作者的结果表明，乳腺肿瘤相关巨噬细胞由TREM2/CADM1和FOLR2的互斥表达分为两个群体。 3.FOLR2是组织驻留巨噬细胞最近的研究发现，TREM2浸润的巨噬细胞与癌症发展有关。作者的数据表明，在乳腺肿瘤中，它们与CD14、CCR2单核细胞的转录接近。这些结果表明，TREM2、CADM1巨噬细胞是在肿瘤进展过程中由循环单核细胞浸润而来。FOLR2巨噬细胞的起源尚不清楚，因此作者想知道它们是否对应于乳腺TRMs或者像TREM2巨噬细胞一样是肿瘤招募的单核细胞源性巨噬细胞。为了回答这个问题，作者通过流式细胞术在健康组织和乳腺腺体肿瘤病变中定量了FOLR2巨噬细胞。作者发现，在APOE巨噬细胞中，FOLR2巨噬细胞在健康组织和肿瘤周围组织中富集。随着肿瘤进展，FOLR2巨噬细胞在APOE巨噬细胞中的频率相对稀释，被FOLR2巨噬细胞所取代。然而，FOLR2阳性巨噬细胞的数量在肿瘤病变中并未减少，因为它们在健康组织和肿瘤组织中的总活细胞中的频率保持不变。通过分析来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的不同亚型的乳腺癌样本，也证实了FOLR2阳性巨噬细胞在肿瘤相邻正常组织与肿瘤病变之间的富集。相比之下，TREM2转录本在乳腺肿瘤病变中富集，而在肿瘤相邻正常组织和非疾病健康组织中较少。免疫组织化学分析显示，FOLR2阳性巨噬细胞存在于所有亚型的乳腺癌中。FOLR2阳性巨噬细胞的批量RNA测序和CyTOF分析显示，FOLR2阳性巨噬细胞特异性地表达LYVE1和MRC1/CD206，这两个标记是周围血管巨噬细胞的标志物。肿瘤切除标本上的共聚焦成像显示，确实在肿瘤和相邻组织中，FOLR2 + CD206 + 巨噬细胞位于CD31 + 血管附近。总的来说，这些结果表明，FOLR2 + 巨噬细胞是与健康MG相关的PV TRMs。
4.FOLR2与乳腺癌患者的巨噬细胞相关，与生存率增加有关巨噬细胞通常被认为促进肿瘤生长并抑制抗肿瘤免疫。这在小鼠模型中已经得到了很好的证实。在人类中，巨噬细胞通常与预后不良和较高的肿瘤分级相关。然而，临床研究通过使用DCs、单核细胞和巨噬细胞共享的标记物来探究巨噬细胞与患者生存率的关联。因此，作者想知道FOLR2巨噬细胞是否与BC患者的生存率恶化有类似的关联。为此，作者定义了基因特征，可以推断总巨噬细胞或FOLR2巨噬细胞亚群在肿瘤转录组中的丰度。三个基因定义了一个核心巨噬细胞特征，这个特征在本研究中鉴定的3个巨噬细胞簇中共享，足以区分巨噬细胞和其他白细胞系谱。三个基因唯一地区分了FOLR2巨噬细胞与其他巨噬细胞和其他白细胞系谱。LYVE1由于其内皮表达而未包含在签名中。作者分析了这些基因签名在乳腺癌的总体转录组中的表达情况。与先前的报告一致，作者发现最高水平的巨噬细胞浸润与较差的总体生存率相关。与之形成鲜明对比的是，高FOLR2基因签名与增加的总体生存率相关。使用相同的截断值，在一个独立的BC患者队列中验证了FOLR2基因签名与患者临床结果之间的关联。作者还分析了52例ER+/HER2-乳腺癌患者中FOLR2蛋白表达与患者预后之间的关联，使用了CPTAC数据集中的肿瘤样本。作者发现FOLR2蛋白丰度与更好的生存率呈正相关。接下来，作者想直接评估FOLR2阳性巨噬细胞的细胞密度是否与良好的临床结果相关。为此，作者使用多光谱成像分析了两个回顾性和独立的乳腺癌患者队列的组织微阵列中的肿瘤样本。作者对FOLR2、细胞角蛋白和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚染色的肿瘤进行了染色，并计算了FOLR2巨噬细胞的细胞密度。使用表现最佳的阈值作为截断点，作者发现FOLR2巨噬细胞密度与患者的生存率呈正相关。由于FOLR2巨噬细胞是健康MG中的组织驻留人群，FOLR2 mRNA的丰度可能与较小的肿瘤相关。为了测试这是否可能是一个混杂因素，作者分析了不同分期和分级的乳腺肿瘤中FOLR2 mRNA的表达水平。作者发现FOLR2的表达在不同分级之间没有显著差异，并且在晚期肿瘤中略有增加。此外，多变量分析显示，校正了各种临床参数后，FOLR2基因签名的预后价值是与激素受体阳性乳腺癌患者的更好生存相关的独立预后因子。总的来说，这些结果表明FOLR2基因特征和FOLR2巨噬细胞的丰度与乳腺癌患者的预后有关。 5.FOLR2的巨噬细胞位于肿瘤基质中，与TREM2的巨噬细胞在各种癌症中空间上分离为了定量评估FOLR2和TREM2巨噬细胞在乳腺肿瘤中的空间分布，作者在包含122名患者肿瘤的组织微阵列上使用多光谱成像。肿瘤巢通过其CK的表达来识别。对肿瘤区域进行自动分类，并进行FOLR2和TREM2细胞的空间分布分析。与作者的免疫组化结果一致，作者发现FOLR2巨噬细胞位于距离肿瘤巢平均95μm的肿瘤基质中。相比之下，TREM2巨噬细胞位于肿瘤巢内部和侵袭边缘附近。围绕肿瘤巢的TREM2巨噬细胞通常形成细胞簇。作者得出结论，与TREM2巨噬细胞相比，FOLR2巨噬细胞主要位于肿瘤基质中，并且距离肿瘤巢更远。在队列1和队列2的组织微阵列中，TREM2的细胞密度与生存没有可重复和显著的关联。有趣的是，TCGA整个肿瘤转录组数据集中的TREM2或TREM2基因签名mRNA水平与TNBC、肾透明细胞癌、胰腺腺癌、低级别胶质瘤和肝细胞癌的生存率较差有关。为了测试肿瘤基质中FOLR2和TREM2巨噬细胞丰度与临床结果的关联性，作者分析了通过激光捕获显微切割BC周围肿瘤基质生成的微阵列数据集。作者发现FOLR2基因签名与更好的生存率强相关，而低FOLR2基因签名表达者的临床结果较差。相反，TREM2基因签名表达较高的患者生存概率降低，高表达者患者属于不良结果患者组。 6.FOLR2富集于CD8 T细胞浸润的肿瘤中，并与淋巴聚集体在各种癌症中共定位为了进一步研究FOLR2与巨噬细胞是否与CD8 T细胞有效互动，作者对新鲜的人类乳腺癌病变进行了共聚焦活体成像。作者使用与CD8、FOLR2和EPCAM结合的荧光抗体对肿瘤病变中的内源性CD8 T细胞、FOLR2巨噬细胞和EPCAM肿瘤细胞进行染色，并通过时间点成像显微镜观察细胞动态。作者观察到FOLR2巨噬细胞定位于肿瘤基质内，并形成一组具有活跃膜褶皱的静止细胞网络。对CD8 T细胞位移速度的定量分析显示出不均匀的行为，有些细胞运动更多，有些细胞运动较少。重要的是，作者反复发现CD8 T细胞减慢了速度，并与FOLR2巨噬细胞建立了持久的接触。与FOLR2缺失的肿瘤区域相比，CD8 T细胞的运动性更高。 作者得出结论，CD8 + T细胞与FOLR2 + 巨噬细胞建立了长时间的相互作用，这种行为很可能促进T细胞的激活。与此结果一致，整个肿瘤转录组中的FOLR2表达与控制T细胞细胞毒功能的基因呈正相关，但与T细胞功能障碍的基因如LAG3无相关性。TREM2表达与控制CD8 + T细胞细胞毒功能的基因没有显著相关性。 7.FOLR2的巨噬细胞对肿瘤生长做出反应并获得T细胞激活能力新生肿瘤已被证明与TRMs进行细胞间相互作用，从而促进肿瘤的生长、运动性和侵袭性。为了探索FOLR2巨噬细胞的功能特性，作者转向PyMT BC小鼠模型。首先，作者想知道健康MG的FOLR2巨噬细胞是否会对发展中的肿瘤做出反应。为此，作者使用批量RNA-seq对健康和小型或中型肿瘤小鼠MG中分离的FOLR2巨噬细胞进行了分析。使用最具变异性的10,000个基因进行主成分分析显示，乳腺肿瘤中分离的FOLR2巨噬细胞的转录组谱发生了与肿瘤大小相关的变化，如PC2轴的变化所示。有趣的是，CADM1巨噬细胞的转录组受肿瘤大小的影响不大，并且与FOLR2巨噬细胞分开聚类。作者发现FOLR2和CADM1巨噬细胞在同一肿瘤中有6139个差异表达基因。作者得出结论，FOLR2 + 巨噬细胞对发展中的肿瘤有反应，但与CADM1 + 巨噬细胞是可分离的细胞实体。作者发现乳腺肿瘤FOLR2 + 巨噬细胞与健康的乳腺腺体FOLR2 + 巨噬细胞之间存在1,356个差异表达基因。在这些DEG中，乳腺肿瘤FOLR2 + 巨噬细胞表达了参与免疫系统正调节的基因，包括B和T细胞趋化因子，粘附分子以及溶酶体蛋白。相反，从健康的乳腺腺体中分离的FOLR2 + 巨噬细胞富含调节代谢过程的基因。因此，作者的数据显示FOLR2 + TRMs对肿瘤发展有反应。
总结一下：作者首先详细地探索了固态癌症中的巨噬细胞浸润，尤其是与人类乳腺癌的关系；第二部分描述了肿瘤相关巨噬细胞在表型和功能上的多样性；第三部分揭示了FOLR2+组织驻留巨噬细胞在健康乳腺和乳腺癌原发肿瘤中的存在；第四部分强调了肿瘤中FOLR2+巨噬细胞的密度与患者生存率的关联，并讨论了巨噬细胞为基础的癌症治疗的未来方向。全篇知识点丰富，为作者提供了很多深入研究的方向，对于免疫领域的研究者来说是一篇不容错过的好文章！ |
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