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1.核 TSPAN8 与肿瘤发生的临床相关性和病理联系此前，作者测定了TSAPN8的亚细胞定位，发现TSPAN8可在多种细胞系的细胞核中被检测到。 为了评估 TSPAN8 核转位的生物学后果和重要性，作者开始研究 TSPAN8 核表达的病理意义。为此，作者使用了一种在体外和体内都具有特异性的商用抗 TSPAN8 抗体，并对原发性人类乳腺癌的临床标本进行了免疫组化染色（IHC）分析。、胃癌、结直肠癌和胰腺导管腺癌。作者的结果表明，与配对的正常组织相比，TSPAN8在多种肿瘤组织中的核表达明显上调。在 BrCa 中，核 TSPAN8 水平与癌症晚期、三阴性亚型、肿瘤体积增大、淋巴结受累、远处转移和间质表型等侵袭性特征呈正相关。此外，作者注意到，与配对的正常组织相比，BrCa 组织中 TSPAN8 细胞核明显染色的细胞与 TSPAN8 主要在细胞质染色的细胞之比明显增加。然后，作者使用 Image-Pro Plus Version 6.2 软件将 BrCas 分成 TSPAN8 核表达高组和 TSPAN8 核表达低组。
2.表皮生长因子-表皮生长因子受体（EGF-EGFR）信号调节 TSPAN8 核转位作者之前的研究结果表明，TSPAN8 与胆固醇结合及随后的膜提取需要特异位点棕榈酰化。 27 同样，作者发现 EGF 处理并没有改变 TSPAN8 的棕榈酰化状态。考虑到 TSPAN8 在细胞中会发生组成型棕榈酰化，作者接下来试图确定 EGF 诱导的核 TSPAN8 最初是来自质膜还是仅仅来自细胞质中新合成的蛋白质。为此，作者采用了质膜抑制、近端依赖性标记策略，在 EGF 处理前通过生物素化对膜上的 TSPAN8 进行预标记。去除生物素后，作者再用 100 ng/mL EGF 处理细胞一小时，然后在指定的时间点收集细胞膜和细胞核部分进行链霉亲和素免疫沉淀，并通过 Western 印迹检测每个区室中生物素化 TSPAN8 的存在。有趣的是，作者发现经 EGF 处理后，膜部分的生物素化 TSPAN8 蛋白水平下降，而核生物素化 TSPAN8 蛋白水平呈时间依赖性增加，这表明核 TSPAN8 最初来源于细胞膜。 3.激酶 AKT 在表皮生长因子-表皮生长因子受体（EGF-EGFR）信号传导过程中直接使 TSPAN8 在 Ser129 处磷酸化由于 AKT 是表皮生长因子-表皮生长因子受体信号转导的下游激酶，作者询问 AKT 是否会直接使 TSPAN8 磷酸化。为了验证这种可能性，作者用抗-PAN 磷酸化-Tyr/Ser 抗体进行了体外激酶检测。活性 AKT 确实能够在体外磷酸化野生型 TSPAN8，这表明 TSPAN8 是 AKT 的真正底物。接下来，作者进行了质谱分析，以确定 EGF 处理时 AKT 磷酸化 TSPAN8 的特定位点。MS 分析表明，TSPAN8 的 S129、T131 和 T196 可能是 EGF 处理时磷酸化的位点。然后，作者使用点突变策略验证了 TSPAN8 的这些候选位点。值得注意的是，TSPAN8 S129A 突变，而非 T131A 和 T196A 突变，在体外取消了 AKT 对 TSPAN8 的磷酸化。TSPAN8 Ser129 的序列比对显示，该残基从狗到人都是保守的。为了进一步研究体内情况是否如此，作者用 EGF 处理了表达 TSPAN8的 MDA-MB-231 细胞。同样，作者在 WT、T131A 和 S196A 表达的细胞中观察到 TSPAN8 磷酸化升高，这种情况在进一步与 AKT 抑制剂 MK2206 培养后大大减弱。 4.磷酸化的TSPAN8通过增强与14-3-3θ和输入蛋白ß1的结合进入细胞核为了研究TSPAN8在EGF-EGFR信号诱导的TSPAN8核转位过程中Ser129磷酸化的潜在作用，作者产生了两种突变体：一种是不能再被AKT磷酸化的TSPAN8 S129A 变体；另一种是模拟其在EGF/EGFR信号激活下被AKT组成磷酸化的TSPAN8 S129D 变体。作者在MCF-7细胞中过表达了WT和突变体TSPAN8，并通过免疫荧光分析检测了各种形式的TSPAN8的核和细胞质部分。如果 TSPAN8 在 S129 处的磷酸化是其核转位的必要条件，那么与 WT TSAPN8相比，作者预计 TSPAN8 S129A 突变体的核分数会减少，而 TSPAN8 S129D 突变体的核分数会增加。与之前的研究结果一致，作者接下来使用siRNA沉默法特异性敲除了MDA-MB-231细胞中的14-3-3θ和导入素ß1，然后用免疫荧光和免疫印迹法重新分析了TSPAN8在核和细胞质中的表达。结果表明，14-3-3θ 或导入素 ß1 的耗竭可特异性抑制 EGF 促进的 TSPAN8 在核部分的积累。综上所述，这些数据表明 AKT 介导的 Ser129 磷酸化促进了 TSPAN8 的核转位，并通过促进其与 14-3-3θ 和导入素ß1 的结合来实现。 5.pTSPAN8 S129 比 TSPAN8 导致更具侵袭性的癌症表型 WT为了进一步确定 AKT 磷酸化 TSPAN8 的病理功能，作者使用了特异性识别 pTSPAN8 的多克隆抗体 S129 。通过使用该抗体，作者发现 MDA-MB-231 细胞中内源性 pTSPAN8 S129 的水平逐渐升高，并在 EGF 处理后 60 分钟达到峰值。此外，作者发现在 EGF 处理 30 分钟后，S100 部分中 TSPAN8 的 Ser129 磷酸化显著增加。然后，作者用该抗体检测了先前用于 TSPAN8 分析的 BrCa 组织中的 pTSPAN8 S129 。不出所料，与配对的正常组织相比，BrCa 组织中 pTSPAN8 S129 的水平明显升高。此外，pTSPAN8 S129 主要定位于细胞核，并与 TSPAN8 核表达呈正相关。此外，pTSPAN8 S129 水平的升高与间质特征和 TNBC 亚型明显相关。综上所述，这些结果表明了 pTSPAN8 S129 与其核定位之间的正相关性，以及 pTSPAN8 S129 在肿瘤进展过程中的重要病理作用。 6.磷酸化的 TSPAN8 与细胞核中的转录因子 STAT3 相互作用为了进一步了解 TSPAN8 在核团中的功能机制，作者分析了 TSPAN8 BioID 试验的数据，发现经 EGF 处理后，在 TSPAN8-BioID 试验中发现了更多转录因子 STAT3 的多肽。随后的 Co-IP 试验进一步证实了 EGF 增强了 TSPAN8 和 STAT3 之间的相互作用。此外，使用纯化的 Flag-TSPAN8 蛋白和 Myc-STAT3 蛋白进行体外牵引试验，发现了 TSPAN8 和 STAT3 之间的直接相互作用。接下来，作者研究了 TSPAN8-STAT3 的相互作用是否在 EGF 处理时由 pTSPAN8 S129 介导。事实上，作者在 MDA-MB-231 细胞中重复检测到了 EGF 增强的 TSPAN8-STAT3 相互作用，然而，无论 EGF 如何刺激，TSPAN8 S129A 突变体的这种相互作用都大大减弱了。相反，与 TSPAN8 WT 相比，即使在没有 EGF 的情况下，TSPAN8 S129D 突变体也显示出更强的 STAT3 结合能力，这表明 pTSPAN8 S129 和 TSPAN8 的核导入主要介导了 TSPAN8 与 STAT3 的相互作用。综上所述，这些结果表明 pTSPAN8 S129 与细胞核中的 STAT3 相互作用，促进癌症进展。
7.pTSPAN8 S129 在全基因组范围内稳定目标基因位点上的 STAT3，从而调控转录鉴于作者发现了 TSPAN8 与 STAT3 的相互作用，作者推测核 TSPAN8 可能与 DNA 上的 STAT3 形成复合物，以调控靶基因的转录。为了验证这种可能性，作者首先对经 EGF 处理的 TSPAN8 缺失 MCF-7 细胞进行了 RNA-seq 分析。在与人类参考基因组比对并归一化后，作者在对照、EGF 和 siTSPAN8 + EGF 细胞中分别鉴定出了 20,312 个、21,536 个和 20,611 个转录本。这些信息被用来评估经 EGF 处理后 WT 细胞和 TSPAN8 缺失细胞之间的转录差异。基因组变异分析清楚地显示，TSPAN8 缺失后，JAK_STAT3 信号转导的富集程度明显降低。在 TSPAN8 + EGF 组中发现了 STAT3_Gene_Set (1366) 42 的 622 个唯一表达的转录本。因此，作者还研究了 STAT3 在 TSPAN8 与染色质结合过程中的重要作用。在这方面，尽管EGF能在一定时间内促进TSPAN8与染色质的结合，但这种结合能力在去除了STAT3的MDA-MB-231细胞中显著降低。事实上，与商业 STAT3 抑制剂 WP1066 43 或 BAY2352 44 共同处理可阻断 EGF 诱导的 TSPAN8 与 MYC、BCL2 和 MMP9 的促进结合，这表明 STAT3 在将 TSPNA8 募集到细胞核染色质中起着至关重要的作用。综上所述，这些结果表明，核TSPAN8与STAT3形成复合物，以核心化它们在靶基因位点上的占据，从而实现靶基因转录。 8.pTSPAN8 S129 通过 STAT3 依赖性基因表达促进肿瘤进展为了进一步评估TSPAN8-STAT3轴在乳腺肿瘤发生中的功能重要性，作者在异种移植肿瘤模型中验证了pTSPAN8 S129 的致癌作用。为此，作者首先将约 1 × 10 6 MCF-7 细胞注射到 Balb/c 裸鼠的乳房脂肪垫中，以培养肿瘤的形成。然后，给小鼠瘤内注射 TSPAN8 WT 、TSPAN8 S129A 或 TSPAN8 S129D 的慢病毒颗粒。与对照载体组相比，作者发现接受 TSPAN8 WT 颗粒的小鼠迅速长出肿瘤，而注射 TSPAN8 S129D 颗粒的小鼠肿瘤长得更大。相反，接受 TSPAN8 S129A 颗粒的小鼠形成的肿瘤比注射 TSPAN8 WT 的小鼠小。IHC 分析进一步证实了这些观察结果，显示 TSPAN8 S129D 组肿瘤组织中细胞增殖标记物 Ki67 蛋白水平要高得多，但与 TSPAN8 WT 组相比，TSPAN8 S129A 组的 Ki67 水平相对较低。为了进一步研究核 TSPAN8 对 STAT3 的功能依赖性，作者给小鼠注射了转染有 TSPAN8 S129D 的 MCF-7 细胞，无论 STAT3 siRNA 存在与否。结果显示，当 STAT3 被耗尽时，TSPAN8 S129D 组的肿瘤体积大幅缩小。进一步的 RNA 范围分析还显示，STAT3 被去除了后，TSPAN8 S129D 诱导的 BCL2 mRNA 表达明显减少。这些发现共同有力地表明，核 TSPAN8 以 STAT3 依赖性方式促进肿瘤进展。
9.用于治疗难治性癌症的人源化抗 TSPAN8 单克隆抗体疗法首先，表面等离子体共振检测显示，hT8 Ab4 抗体在体外能与纯化的抗原 TSPAN8-LEL-Fc 发生剂量依赖性结合。此外，熔点测试表明该抗体在低于 70 °C 的温度下显示出良好的蛋白质耐受性。此外，Western 印迹分析表明，hT8 Ab4 抗体在 TSPNA8 异位表达或耗竭样本中都显示出极好的特异性。接下来，作者利用不同的癌细胞系评估了 hT8 Ab4 是否具有体外抗肿瘤活性。首先，用 hT8 Ab4 处理 MDA-MB-231 细胞可显著减少 EGF 刺激的 TSPAN8 核易位。因此，用 hT8 Ab4 处理可剂量依赖性地降低乳腺癌细胞的生长和细胞侵袭。此外，与TBNC肿瘤中TSPAN8核定位异常一致，作者发现MDA-MB-231细胞及其衍生物4175细胞对hT8 Ab4 介导的抗增殖作用比MCF-10A细胞更敏感。然后，作者验证了 hT8 Ab4 对裸鼠人乳腺癌异种移植瘤的疗效。通过瘤内注射hT8 Ab4 能显著抑制 MDA-MB-231 细胞系异种移植瘤的生长。使用肿瘤追踪分子生物共轭物 Tumor Paint进行成像显示，1 或 10 mg/kg hT8 Ab4 治疗小鼠的肿瘤大小在第 14 天均有所减小。对治疗后肿瘤生长情况的分析表明，hT8 Ab4 治疗小鼠的肿瘤负荷显著减少。综上所述，这些结果证实了核TSPAN8/pTSPAN8 S129 -STAT3在肿瘤发生中的病理作用，并进一步证明了以核TSPAN8为靶点治疗癌症的概念。 至此，这篇文章就分享完啦！简单回顾一下：文章开篇详尽地阐述了固有免疫与适应性免疫中ILCs和ILTCs的特性；接下来，作者深入探讨了它们在癌症免疫监控中的核心角色；在第三部分，作者了解到了作为连接适应性免疫与固有免疫的关键桥梁的机制；最后，文章描述了基于ILC和ILTC的免疫疗法及其未来的治疗潜力。这篇文章内容丰富，为作者提供了许多生信分析的研究方向，对于从事免疫研究的朋友们来说，绝对值得一读！ |
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