不同水解方法对葡萄酒厂废渣中齐墩果酸含量的影响

【关键词】 葡萄皮废渣,齐墩果酸,水解

　　摘要：目的： 考察不同水解方法对葡萄酒厂废渣中OA含量的影响。方法：采用未水解法、酸解法、酶解法、酶解法+酸解法4种方法对葡萄榨汁后废渣进行处理，采用醇提法提取出其中的齐墩果酸，并进行含量测定和比较。结果：优选的水解方法为酶解法。结论: 所建立的水解方法稳定、可靠，适合于工业生产。

　　The effect of different hydrolysis method on the content of oleanolic acid in waste residue of grape winery

　　TIAN Liting, MA Long, DU Niansheng, et al

　　(College of Public Health, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)

　　Abstract: Objective: It was studied to compare different hydrolysis methods on the content of oleanolic acid in waste residue of grape winery. Methods: The waste residue of grape winery was handled by four different methods, after extracting the oleanolic acid, we measure the content of oleanolic acid and compare the effect of the four methods. Result: The better hydrolysis condition is: fermenting the waste residue of grape winery naturally under 37℃ for 24 hours. Conclusions: The method we chosen is steady and reliable for industrial use.

　　Key words: waste residue of grape winery; oleanolic acid; hydrolysis

　　新疆为瓜果之乡，在特殊的地理条件下，新疆葡萄不仅味美而且产量高、品质好。葡萄除鲜食、制干、制汁、酿酒外，还被维吾尔医广泛入药[1]。葡萄有强身健体、补肝利胆、软化血管的作用，并有益于防治贫血、肝炎等疾病[2]。然而葡萄制品在生产过程中会留下大量废渣。全国第五次工业普查结果显示，1995年底我国共有葡萄酒企业240多家，从1996年至2005年，全国新增葡萄酒企业200多家，估计总数已近500家。本着充分利用新疆资源的构想，本课题组对葡萄进行了开发与应用的基础研究，首次从葡萄皮中分离得到一种生物活性物质――齐墩果酸(oleanolic acid，OA)[3]。预试验表明葡萄皮渣中不仅有游离型齐墩果酸，还有结合型齐墩果酸。为了能最大限度地提取出齐墩果酸，本研究考察不同水解方法对葡萄酒厂废渣中齐墩果酸含量的影响，以期为建立齐墩果酸的提取工艺提供一个现实可行的前处理方法。

　　1实验材料与仪器

　　1.1材料葡萄酒厂废渣购自某葡萄酒厂，品种由自治区园艺所杨承时研究员鉴定。

　　1.2仪器及试剂UV 754 GD型紫外/可见分光光度计(上海分析仪器总厂)，HP1100高效液相色谱仪(美国惠普公司)，齐墩果酸标准品(北京生物制品检定所)，乙醇(工业用);其它试剂均为分析纯。

　　2实验方法与结果

　　2.1水解方法设计(1)方法A：称取干燥的葡萄皮5.00 g，直接醇提。(2)方法B：称取干燥的葡萄皮5.00 g， 加入 50 ml 2N HCl回流水解6 h，过滤，弃滤液，水洗滤渣至中性，再醇提。(3)方法C：称取干燥的葡萄皮5.00 g，加适量水润湿后37℃自然发酵48 h，然后醇提。(4)方法D：称取干燥的葡萄皮5.00 g，加水润湿后37℃自然发酵48 h，干燥，加入50 ml 2N HCl回流水解6 h，过滤，弃滤液，水洗滤渣调pH至中性，再醇提。

　　2.2测定液制备按方法A、B、C、D制得的4份样品醇提后浓缩得浸膏，分别加水约30 ml混悬，加热30 min放冷，等量乙醚萃取4次，合并乙醚层，回收乙醚液;残渣用乙醇( AR级)溶解、过滤、定容至50 ml，得A、B、C、D测定液。

　　2.3A、B、C、D测定液中OA含量测定采用比色法[4]测定OA含量。

　　2.3.1对照液和供试液制备精密称取OA标准品10.2 mg，乙醇溶解，定容至10 ml，制成1.02 mg/ml的贮备液;精密吸取贮备液2 ml，乙醇定容至10 ml，作为对照液(0.204 mg/ml)。从测定液A、B、C、D测定液中分别精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，95%乙醇定容至刻度，作为供试液。

　　2.3.2标准曲线制备分别精密吸取0.204 mg/ml的OA对照溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml容量瓶中，水浴上挥干溶剂;另取一10 ml容量瓶作为标准液空白，与标准系列同时分别加入5%香草醛冰醋酸溶液0.4 ml，高氯酸1.6 ml，摇匀;70℃水浴恒温15 min取出，冷至室温，用乙酸乙酯稀释至10 ml，摇匀，备用。用标准液空白调零后于560 nm处测定吸光度。以浓度对吸光度回归，得标准曲线方程：Y=0.044 9X-0.020 4(r=0.999 8)。结果表明，浓度在4.08~20.4 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

　　2.3.3稳定性试验精密吸取对照液0.2 ml，按照标准曲线项下操作，每隔5分钟测定1次吸光度，共测12次，吸光度值分别为 0.165、0.157、0.155、0.155、0.155、0.156、0.175、0.154、0.165、0.155、0.160、0.155，平均吸光度为0.159，RSD为3.84%。结果表明在1 h内测定吸光度稳定。

　　2.3.4精密度试验取同一份葡萄皮原料制成的测定液，按样品测定顺序平行测定6次，测得吸光度为0.415、0.410、0.440、0.419、0.410、0.420，平均吸光度为0.419，RSD为2.65%。

　　2.3.5回收率试验精密称取已知OA含量的葡萄皮0.500 g，共9份，分3组，每组分别加入OA对照品贮备液(1 mg/ml)1、2、3 ml，按2.2及2.3.1项下操作。精密吸取供试液0.2 ml于10 ml容量瓶中，按标

　　2.3.2项下操作，结果9次测得平均回收率为100.12%，RSD为3.28%。

　　2.3.6样品测定分别吸取供试液0.2 ml于10 ml容量瓶中，按2.3.2项下操作，依法测定，计算OA含量，直接醇提法提取出的OA量相对较少，酶解+酸解法提取出的OA量相对较高，结果见表1。表1比色法测定齐墩果酸的含量(略)

　　2.4A、B、C、D测定液中OA含量测定采用HPLC法测定OA含量。

　　2.4.1色谱条件色谱柱为Eclipse XDBC18柱，流动相为甲醇―水(85∶15)，流速1 ml/min，UV波长220 nm，温度40 ℃ ，数据处理为外标法峰面积定量。

　　2.4.2色谱曲线OA高效液相色谱图见图1a与1b。

　　2.4.3标准曲线绘制精密吸取OA贮备液0.15 ml，置5 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成30 μg/ml的对照溶液。精密吸取对照液2、4、6、8、10 μl进样，以进样量对峰面积值回归，得标准曲线方程：Y=182.79X+1.497 6(r=0.999 0)。结果表明，进样量在0.06～0.45 μg范围内呈良好线形关系。

　　2.4.4精密度试验日间差：精密吸取样品溶液，在1 d内每隔1小时测定1次，共测6次，每次进样5 μl，样品中齐墩果酸峰面积积分值的RSD为1.63%;同一份样品溶液，每隔1天测定1次，连续5 d，每次进样5 μl，测得样品中齐墩果酸峰面积积分值的RSD为1.65%。

　　2.4.5重复性试验同一批样品，平行6份，按相同方法处理测定，测得样品中齐墩果酸峰面积积分值的RSD为1.61%。

　　2.4.6加样回收率试验精密称取已知含量的样品，共9份，分别加入1 mg/ml齐墩果酸对照品的甲醇溶液0.2、0.4、0.6 ml，每组3份，按2.3.6项下测定，结果9次测得平均回收率为101.68%，RSD为2.05%。

　　2.4.7样品测定将供试液用微孔滤膜(φ=25 mm, 4.5 μm)过滤，弃去初滤液，吸取续滤液5 μl进样，得峰面积值，代入标准曲线方程中计算OA含量。结果：方法A(未水解)与方法B、C、D相比差异有统计学意义(P<0.01)，而方法B、C之间差异无统计学意义;方法D尽管是方法B+方法C，但所得OA含量与方法B、C差异无统计学意义(表2)。考虑到操作的繁简和工业化生产成本等因素，本研究选择方法C对样品进行前期处理，即将葡萄皮加水湿润后37 ℃自然发酵48 h。表2HPLC法测定齐墩果酸的含量(略)注：与方法B、C、D相比， *P<0.01

　　3讨论

　　本研究采用2种方法测定了葡萄废渣中OA的含量，结果表明比色法简单易行，但所测结果是废渣中的包括齐墩果酸在内的三萜类化合物总含量，不能精确测定齐墩果酸的含量;高效液相法则可以较准确的测定其含量。

　　本试验证明较为可取的水解方法是自然发酵法和酸解法。与自然发酵法相比，酸解法引入了酸而使得样品在用乙醇提取前增加了一步用水洗至中性的过程，而自然发酵法过程简单且不影响其后的提取过程;葡萄皮在发酵前呈蓬松状态，发酵后体积减小，从而减少了乙醇的用量，降低了生产成本;同时，经实地考察发现葡萄榨汁后湿润的皮渣留在池中未作任何处理，可待其自然发酵后再干燥进行其后的工业生产。因此我们认为自然发酵更为可取。

　　参考文献：

　　[1]马龙,邓淑文,屈卫东,等.新疆和田红葡萄干保健功能试验研究[J]. 新疆医科大学学报.1999,22(1):37.

　　[2]Liu J. Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmocol ,1995, 49:2,5758.

　　[3]赵江霞，马龙，堵年生，等. 新疆和田红葡萄果皮化学成分的研究[J]. 新疆医科大学学报. 2001,24(3)189191.

　　[4]湖南省药品检验所,陈明珠. 齐墩果酸片的比色测定[J]. 中草药,1981,12(9):1315.

　　基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(20002)