肿瘤研究的新热点

作者单位：江苏南通大学医学院病理教研室;2.美国Biomics Biotechnologies （NT）Co., Ltd

【关键词】  eb病毒；感染；肿瘤

eb病毒(epsteinbarr virus,ebv)属于γ疱疹病毒亚科的成员之一，是人类一种特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒。它主要通过人类唾液传播，因此呼吸道是eb病毒潜伏的最大场所。在发展中国家感染期较早，约3～5岁已达高峰，80%以上的5岁儿童eb病毒血清学阳性。根据血清学调查，我国3～5岁儿童eb病毒vcalgg抗体阳性率达90%以上，幼儿感染后多数无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染；而在发达国家，由于卫生条件较好，只有40%～50%的5岁儿童的eb病毒血清学阳性，其感染常推迟至青年[1]，15～20岁到高峰[2]。根据调查的结果，世界人口的90％以上都存在eb病毒的潜伏感染，或成为eb病毒携带者[3]。更重要的是eb病毒感染与越来越多的人类恶性肿瘤有关，应用原位杂交证明了携带高拷贝eb病毒除了能转化淋巴细胞外，也能赋予肿瘤细胞一定的生长优势，使其成为优势细胞群，呈现转化特征。eb病毒引发了全球癌症的1％，并占所有感染性癌症的5.6％[4]。根据国际癌症研究署对致癌因子的分类标准，eb病毒被列在第一组致癌因子中[5]。

    1  ebv感染与疾病的关系

    临床eb病毒感染往往引起感染性多脏器损害，以肝脏损害最多见，占25％ ；心脏占4.1％；血液系统占2.5％；肾、脑等损害也有发现。现在明确的是：eb病毒除与鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，npc）、多种淋巴瘤的发生有关[6]，也与肺癌[7]、胃癌[8]、子宫颈癌[9]、口腔腺体肿瘤、肾肿瘤、胸腺瘤等多种肿瘤的发生有关。

    eb病毒的致癌作用需与促癌因素的进行协同，成年人普遍存在eb病毒潜伏感染，但只有少数人发生eb病毒相关肿瘤，并且这些肿瘤的发生存在人种、地区和性别的差异。npc是我国南方最常见的肿瘤，在东南亚华人中和北非也有较高的发病率，每年约有80 000以上的新病例发生。据who统计，大约80%的npc发生在中国[10]。burkitt淋巴瘤是非洲儿童的一种常见恶性肿瘤，多发生在15岁以前，死亡率很高[11]。npc与burkitt淋巴瘤的发生具有明显的地区限制，说明这些疾病的发生还有着其他协同因素。因此，eb病毒与促癌物等其他因素的协同作用值得进一步研究。

    1987年begin等[12]报道了首例与eb病毒有关的肺淋巴上皮瘤样癌；lung等[7]以支气管脱落细胞为材料进行eb病毒检测．发现eb病毒感染与肺癌发生有关；国内张雷等[13]对北京市各种类型的肺癌蜡块标本87例进行eb病毒检测，结果显示肺癌组织中eb病毒感染率达59.8％，发现肺癌组织中eb病毒感染拷贝数明显高于癌旁肺组织，并提出eb病毒感染与肺癌细胞的生物学特性及肺癌的发展有关；冯新珠等[14]研究发现肺癌患者血清中igg抗体和癌组织中的eb病毒增高，并呈正相关，说明血细胞和癌组织中的eb病毒与肺癌的发生、进展有一定关系[14]；但贾心善[15]用eber1分子杂交法检查沈阳市58例肺癌，结果均为阴性，可见eb病毒感染有明显的地区差。

    已知约10％的普通胃腺癌[8]，80％ 以上的胃淋巴上皮样癌[16]和35％的残胃癌发病与eb病毒感染有关[17]，故称这类胃癌为eb病毒相关性胃癌 (epsteinbarr virus associated gastric carcinoma，ebvagc)。在全球每年新增近90万例胃癌患者中，ebvagc的绝对数字远远超过其他eb病毒相关肿瘤的病例。研究发现eb病毒和ebvagc癌变存在一定的关系：首先在所有ebvagc癌细胞中都有eb病毒的表达，而在癌周正常和高度增生的黏膜细胞中则检测不到eb病毒的表达[18] ；其次，eb病毒以附加体的形式存在于感染细胞核内，即线状双链dna形成游离环状分子，且eb病毒末端重复序列的数目一致，提示肿瘤系单一感染eb病毒的癌细胞单克隆增生所致；第三，有证据表明与其他eb病毒相关肿瘤相似，ebvagc临床诊断前患者血清存在高效价的抗病毒抗体，提示ebvagc发生之前存在活动的eb病毒感染。

    早在1993年landers等[19]在18例子宫颈癌组织中发现了8例有eb病毒感染；同年se thoe等[20]用同样的方法在63例子宫颈癌组织中检出eb病毒dnas；郭邑等[21]在2003年发现56例子宫颈癌患者肿瘤中有eb病毒感染，该实验还发现，宫颈癌组eb病毒阳性率明显高于正常宫颈组，结果支持了eb病毒感染可能与子宫颈癌的发病有关。

    最近的研究发现eb病毒个别编码蛋白可使淋巴细胞永生，并在eb病毒有关的其他淋巴瘤发病中发挥主要作用。如霍奇金淋巴瘤、接受免疫抑制治疗的器官移植患者的淋巴瘤、艾滋病人的中枢神经系统淋巴瘤、以及皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等 [6]。

    2  eb病毒生物学性状

    eb病毒为圆形、直径180nm，基本结构包括核样物、衣壳和囊膜三部分。核样物为直径45nm的致密物，主要有双股线性dna，其长度随不同毒株而异，平均为17.5×104 bp，分子量108d。衣壳为20面体立体对称，由162个壳微粒组成。eb病毒在细胞核内装配好的病毒颗粒在穿过核模时获得病毒的囊膜，通过细胞质中的高尔基体等内膜系统，包裹在细胞的运输小体中，从细胞膜上芽生释放。囊膜由感染细胞的核膜组成，其上有病毒编码的膜糖蛋白，有识别淋巴细胞上的eb病毒受体，及与细胞融合等功能。此外在囊膜与衣壳之间还有一层蛋白被膜。eb病毒在细胞中的生活周期可分为潜伏期、立即早期、早期、病毒dna复制期和晚期。感染b淋巴细胞的大部分病毒都处于潜伏状态。此时病毒的线状dna环化形成游离于细胞染色体外的附加体（episome），其结果导致受感染细胞的转化获得永生化的能力。eb病毒仅能在b淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。

    被病毒感染的细胞可产生各种抗原，能刺激机体产生相应的抗体。eb病毒的抗原成分有：eb病毒核抗原（ebvspecified nuclear antigens，ebna）包括ebna1、2、3a、ebna4（3b）、ebna6（3c）和ebna5（leader protein，lp）等6类。早期抗原（early antigen，ea）分为两类：一类在细胞核和胞浆中广泛存在的称为弥散型早期抗原（ead）；另一类大部分在核附近的细胞质中，称为局限型早期抗原（ear）。ead和ear都不是由单一的抗原构成的，而是由多种抗原构成的复合物。病毒的晚期抗原主要有组成病毒核衣壳的病毒衣壳抗原（viral capsid antigens，vca）、淋巴细胞识别病毒靶抗原（viral target antigen lydma）和病毒的晚期膜抗原（membrane antigens， ma）。ma包括潜伏膜蛋白（latent membrane proteins，lmp1、2a和2b），以及编码bamhi—a片段区的barts和不翻译为蛋白的小rna分子eber。lmp1分子大小为60～66 kd，是由386个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，包括一个由24个氨基酸残基组成的n末端和一个与信号传导密切联系的由200个氨基酸残基组成的羧基端胞浆域及6个跨膜疏水结构域。跨膜区能在胞膜上聚合，这对于lmp1发挥其生物学效应具有重要意义；eber （the genome of ebv encodes two epsteinbarr virusassociated small rnas, eber),不具聚腺苷酸尾巴，有eber1（166 bases）及eber2(172 bases)二种。已证明抗ma的抗体能中和eb病毒，但是体液免疫系统仅能阻止外源性病毒感染，却不能消灭病毒的潜伏感染。处于这种状态下的病毒只表达大约10种左右的病毒蛋白，主要有ebna1、2、3a、3b、lp、3c、lmp1、lmp2a、lmp2b。

    3  eb病毒致病性

    eb病毒是由感染的唾液腺淋巴细胞通过细胞对细胞接触而实现首次对口咽部上皮细胞的感染，并在这些细胞中进行活跃复制，新分泌出来的病毒颗粒可以穿过旁边的膜或感染的宿主b淋巴细胞传播给其他的上皮细胞。虽然eb病毒可刺激b细胞增殖，同时也形成了一种针对eb病毒抗原的强t细胞获得性免疫反应，在有免疫活性的宿主身上，eb病毒感染有效的被保存下来。由于正常的免疫监视功能，潜伏感染的eb病毒被控制在相对静止状态，病毒的持久性正是通过潜伏性而实现。eb病毒感染主要通过病毒与细胞表面的病毒受体cd21来完成的。cd21又称作cr2或c3dr，其本身是补体片段c3d的受体。b淋巴细胞表面有cd21分子，而大部分的上皮细胞表面未发现。但当cd21分子人为地插入表皮细胞表面后，这些细胞可被eb病毒感染，产生有感染的病毒颗粒。并进入血液循环而造成全身性感染。

    遭受感染的b淋巴细胞可有二种命运：（1）因溶解感染而被消灭，释出大量病毒颗粒，并感染周边上皮细胞与b淋巴细胞，将感染扩大；（2）成为转化的淋巴细胞并开始增殖。溶解感染及转化淋巴细胞都在其细胞表面表达有病毒抗原，故可由eb病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t cells，ctl)将之清除。但部分的转化淋巴细胞可因无病毒抗原表达而移行为0型潜伏感染，作为记忆b淋巴细胞而保留下来。此种记忆b淋巴细胞可因抗原刺激等契机而被激活，其中eb病毒活化则能进一步感染周边上皮细胞与b淋巴细胞，或由二次性ctl应答而被迅速清除。上皮细胞感染几乎全是溶解感染，此时生成的eb病毒排泄于唾液中而成为传染源。潜伏感染于记忆b淋巴细胞中的eb病毒是否被激活，取决于病毒的表达和宿主防御机制之间的抗争。在免疫抑制期间，机体免疫功能低下，潜伏的eb病毒活化形成的复发感染，常伴有临床上的明显疾患，包括淋巴瘤和其他肿瘤的发生。eb病毒潜伏感染激活有三种可能的途径：（1）快反应形式，接进入溶解感染状态；（2）迟发反应形式，胞转化成淋巴母细胞样形态；（3）不进入溶解感染状态，病毒潜伏感染仅少量病毒复制。eb病毒相关肿瘤都能检出eb病毒潜伏感染状态基因产物，而血清学检查抗体水平升高，说明有eb病毒溶解感染。

    在eb病毒溶解性感染的细胞里，bvdna呈线状形式。潜伏性感染时，bvdna通过基因组末端连接而环化，以游离体形式存在，大多数burkitt淋巴瘤和鼻咽癌可检测；同时ebvdna也可整合至细胞染色体， 它的整合与染色体异常紧密关联，可导致一些与细胞生长、肿瘤形成有关的重要基因表达异常，促进细胞恶性转化[22]。其可能机制：一方面肿瘤细胞存在染色体不稳定性，经常发生dna的重组，eb病毒因此整合到dna已受到损伤的部位；另一方面eb病毒整合可以提高染色体的不稳定性，引起更深层次的基因水平变化。目前已证实eb基因组的整合可影响到一些癌基因与抑癌基因的功能[2324]。

    3.1  ebna  ebna1结合到eb病毒的orip上（eb病毒的dna复制起点p），使eb病毒的dna得以在细胞核中维持。同时ebna1还激活其他ebna基因的转录。多伦多大学的研究人员已经确定ebna1通过与细胞中的特殊蛋白结合而干扰细胞生长调节，并使细胞“永生化”,最终使人患上某种癌症，ebna1对于eb病毒潜伏状态的维持是必须的。ebna2可激活lmp1，lmp2和cd21、cd23和cfgr基因表达。cd23分子是b细胞的生长调节因子之一[24]，而cfgr是src原基因家族的一员，它编码一种蛋白激酶，可能是调节b细胞生长的重要调节物质。ebna3为ctl主要靶位，可激活cd21基因表达，eb病毒的潜伏蛋白还激活某些b细胞基因的表达。

    3.2  eber  eber大量存在于潜伏期细胞核中，是细胞体外转化所不可缺少的。它普遍大量表达于eb病毒相关性癌细胞中,对于肿瘤的恶变与凋亡抵抗性有重要作用。有研究揭示eber与同ifn抗病毒活性相关的双股链rna依赖性蛋白激酶(pkr)相结合而可抑制该激酶活性[25]。在切片中见到中～大的淋巴细胞或核型不规则的细胞呈eber阳性，提示该细胞已经发生活化和转化，表明这些细胞不是潜伏状态的细胞。如果是在疾病状态，eber阳性的细胞数量会增多，一张切片至少大于3～5个。因此，潜伏状态和疾病状态的eb病毒感染在eber阳性的细胞形态和数量上都有所不同。

    某些化学因素（如tpa、丁酸等）和抗igm抗体等多种物质刺激导致eb病毒立即早期蛋白的bzlf1基因的表达，它在eb病毒从潜伏周期进入繁殖周期的过程中起着关键作用。其产物zebra上调了包括自身基因内的立即早期基因包括的表达。立即早期基因产物进一步激活eb病毒早期基因的表达，包括eb病毒自身的dna聚合酶和tk激酶的表达，为病毒dna的复制、晚期结构蛋白的表达奠定基础。

    3.3  lmp1  lmp1目前被广泛认为是eb病毒的致瘤基因，它能够促进增殖、抑制分化、引起细胞发生恶性转化。随着对lmp1分子结构研究的深入，对其介导的信号转导通路及生物学功能研究取得了突破性进展。lmp1有可能成为eb病毒相关肿瘤治疗的分子靶标。

    lmp1在b细胞永生化上起最重要的作用。现知，cim0配体il4的b细胞活化同eb病毒的b淋巴细胞活化机制非常相似，即可认作lmp1模拟介导cim0，而形成细胞激活的信号传导系统。lmp1作为不需要配体的持续活化的膜蛋白能够模拟cd40分子（tnf的受体），募集肿瘤坏死因子受体家族成员来介导其对细胞凋亡的调控。cd40对细胞生长的调节是受到它与配体的结合，而lmp1能够不断刺激细胞生长信号的传递，使细胞的生长失去控制。lmp1的羧基末端细胞质内的2个区： ctar1(carboxy terminal activating region 1 ，194～231aa位中)，通过traf2 (tumor necrosis factor receptor associated factor 2)介导大约25％nfκb激活，并通过traf3直接上调egfr的表达；另一个位于351～386位的 ctar2，它与tradd (tumor necrosis factor associated dead domain)作用可介导75％的nfkb激活，活化的nfκb调节p53、cyclind1、mmp9等下游基因的表达[26]，因ctari与ctar2在淋巴细胞永生化上甚为重要，又被命名转化效应部位(transformation effector site，tes)，而在其活性表达上认为nfκb活化最为重要[27]。活化的nf-κb通过调节凋亡相关蛋白的表达来调控细胞凋亡,lmp1通过调节细胞内信号传导通路，反式激活细胞内凋亡相关分子，介导线粒体通路和死亡受体通路两条细胞凋亡通路，从而实现其对凋亡的调控；同时lmp1在表皮细胞中表达能够改变细胞的形态，在b淋巴细胞中能够抑制细胞的程序死亡。还能增强癌基因bcl2的表达。说明lmp1具有促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡双重生物学效应。

    变异的eb病毒lmp1基因(bnlf1基因)普遍被认为是肿瘤发生过程中一个重要的癌基因。lmp1基因外显子1编码的多肽(n末端区)和外显子3编码的多肽(c末端区)是肿瘤发生过程中非常重要的跨膜和胞膜内功能域。林素暇等[27]研究发现：广州地区鼻咽癌中eb病毒lmp1基因的序列变异类型以xhoⅰloss／de1 lmp1占主导；它的n末端区xho ⅰ酶切位点的丢失很可能是在c末端区30bp缺失的基础上发生的；4种序列变异类型可能代表了npc癌变过程中eb病毒在宿主内演变的4个时相。有研究指出npc患者可以把有可能更具致癌性的eb病毒变异型(比如xho  ⅰloss／dellpm1)分泌到唾液中去，重新感染其他个体，结果使流行地区的正常人群携带的有可能更具致癌性的eb病毒变异型的比率与非流行地区相比较发生了改变，这将导致流行地区与非流行地区人群携带的eb病毒出现所谓的地域性差异[28]。

    张志伟等[29]用plnsx plnsxlmp1和plnsxlmp1ttradd质粒分别与ecadherin报告基因共转染293细胞，检测lmp1对ecadherin启动子活性的影响。结果显示：抑制ecadherin启动子活化可能是ebvlmp1下调ecadherin蛋白表达、促cne2细胞迁移的机制之一。tradd结合位点是lmp1导致cne2细胞迁移，表型改变和ecadherin表达抑制的功能区域，提示lmp1可能直接参与了npc的发生发展与侵袭转移。同时还发现lmp1体外转化的人角质细胞系bhek1不仅产生了形态学改变，而且获得了体内致瘤的恶性表型，lmp1表达阳性的人鳞癌细胞系scc12的分化也受到明显抑制，还能够使肾上皮细胞(mdck)产生形态学转化和浸润性生长[30]等。

    4  eb病毒感染的诊断和治疗进展 

    目前主要有原位pcr和rtpcr技术、荧光定量聚合酶链反应(fqpcr)、酶联免疫吸附试验[31]，对ebvdna以及ebnas、lmps和ebers或其他转录产物进行检测。

    原位杂交检测中所用靶基因是ebvdna bamhiw、eberl，少部分是 pol1与lmp2片段，它可探查经甲醛固定，石蜡包埋的npc标本，能在肿瘤细胞原位检测eb病毒的存在，具有定位准确，特异性强的特点。但是探针价格昂贵；为避免浪费试剂，常选择的npc组织较小；有时npc组织固定欠佳，组织中核酸的变性、弥散，有效结合点减少，染色可能会出现阳性标记弱，甚至假阴性。免疫组化检测常用eb病毒编码的lmp1膜蛋白，它不能检测出病毒的定位和转录数量。但由于免疫组化方法相对于原位杂交有步骤简单、操作方便、检测灵敏度比较高、价格便宜等优点，可以把它作为一项eb病毒的初筛手段，待免疫组化阳性后再用原位杂交方法排除假阳性可能。两种方法联合应用会减少假阳性及假阴性的机会，从而提高检测的准确性。

    由于npc外周血循环的游离ebvdna的拷贝数随着全身化疗周期的进行呈现动态的变化，所以检测npc患者ebvdna的表达水平对判断病灶残留、复发、转移、判断治疗的敏感性、或作为综合治疗方案及时更改、确认以及判断疗效、预后均有重要的指导意义，已经成为npc诊治中重要的血清分子标志物。lo等[32]采用定量pcr技术研究发现:96％的npc患者血浆中能够检测到ebvdna的表达，晚期较早期的表达水平明显增高，在放疗结束1月后，肿瘤被抑制者ebvdna保持低水平，而复发者则再次升高。同时对ebvdna代谢动力学特征分析显示:在放疗过程中ebvdna的生物半衰期为3.8天。to等[33]证实:手术完全切除npc患者血浆中的ebvdna的表达水平，随访6.7天后下降至0，其中位半衰期为139min，若血浆中能够检测到ebvdna的表达水平，则绝大多数出现临床复发，可以推测：检测npc患者血浆中ebvdna的表达水平，一方面能够敏感反应疗效与转归；另一方面还能够判断临床放、化疗的敏感性及近期疗效。makitie等[34]研究指出：检测npc患者外周血ebvdna的拷贝数与正电子发射计算机断层显像(pet)检查对监测局部复发或远地转移具有一致性。这为npc患者治疗后检测病灶残留、评价疗效、判断复发、转移以及预后提供了一种新的无创敏感的方法。lin等[35]研究表明:npc治疗前血浆中ebvdna的表达率为94.95％，而健康者及治愈后均为0，且治疗前血浆中ebvdna表达水平≥1 500拷贝／ml的总生存率及无复发生存率明显低于<1 500拷贝／ml者，放疗结束后1周血浆中能够检测到ebvdna表达者的总生存率及无复发生存率明显低于不能检测到ebvdna表达者。

    对于ebv感染的预防已有二种疫苗问世，一种为我国用痘病毒载体同时表达ebv gp320和hbsag抗原，重点使用在npc高发区；另一种为提纯的病毒gp320膜蛋白，正在英国大学生患者中作小规模接种，以期观察该疫苗是否能降低传染性单核细胞增多症的发病率。

    由于eb病毒与多种疾病的发生有关，所以eb病毒可作为一个有前途的病毒特异免疫治疗靶。分子靶向治疗患者外周血中或肿瘤组织中ebvdna将是治疗eb病毒感染的较好思路。

【参考文献】