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鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征以及直径，对其进行区分鉴定。 外泌体形成于早期胞内体，在内吞体转运复合体（ESCRT）及一些相关蛋白的调控下，早期胞内体发生内出芽形成多个腔内小囊泡，构成多胞体（MVB），MVB 最后在GTPase家族中的RAB酶调解下与细胞膜融合向外界释放囊泡。 wode 外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的细胞外囊泡标志物。 这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，他们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），直接参与了细胞外囊泡内容物的分选；TSG101是ESCRT复合体相关的蛋白，而ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器。ALIX直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的过程。 可选实验操作步骤： （1）超离后获得外泌体，加入PBS重悬或者加入蛋白裂解液（若外泌体量小，加入裂解液后可省略离心取上清步骤）。 （2）对外泌体以及对照细胞裂解样品进行蛋白BSA定量。 （3）向每个管中加入5xSDS样品缓冲液，稀释至1X。 （4）95℃加热5分钟，使蛋白变性。 （5）将样品5-10 ug样品进行上样，选用10％或12％的凝胶进行电泳，检测标志蛋白。 在进行WB验证时，最好也选择一些外泌体没有而细胞总蛋白才有的标志蛋白，如GRP94，EEA1，GM130，PMP70等。 若更确切的去鉴定外泌体，则需要通过外泌体免疫胶体金电镜来观察蛋白质在外泌体中的位置。 现代先进的扫描电镜的分辨率已经达到1nm左右，足够用来进行外泌体尺寸的测量，在外泌体研究中，能够直接观察到样品中外泌体的形态。 可选实验操作步骤： （1）超离后获得外泌体，加入2％戊二醛，4℃固定。 （2）磷酸缓冲溶液漂洗4次，每次15分钟。 （3）1％四氧化锇将样品后固定2小时 （4）ddH2O漂洗两次，每次10分钟。 （5）2%碳酸铀水溶液染色2小时。 （6）脱水：50％乙醇溶液-70％乙醇溶液-90％乙醇溶液-100％乙醇溶液-100％丙酮1-100％丙酮2，4℃孵育15分钟。 （7）渗透：并加入1：1丙酮：包埋剂，室温孵育2小时。然后加入纯包埋剂，室温孵育过夜。 （8）使用包埋模具进行包埋。 （9）聚合：37℃恒温箱12小时-45℃恒温箱12小时-60℃下烘烤48小时。 （10）制备超薄切片。 （11）在透射电子显微镜下观察。 以上两种方法是最常用的外泌体的鉴定方法，是展开外泌体功能研究的前提。比如在肿瘤研究中，通过提取鉴定不同细胞系中的外泌体，进而通过PCR以及测序筛选分析RNA，探究外泌体在肿瘤进展或者耐药中的发生机制。 外泌体像一把“双刃剑”，与癌症进展有着密切的联系，参与促进癌细胞的增殖与扩散，对癌症的发生及恶化有着重要的作用。但外泌体又可以应用于癌症的诊断与治疗，目前外泌体在癌症诊断与治疗中的应用尚处于初级阶段，未来仍需要对外泌体的作用进行更深入地探究，使其更好地应用于临床。 |
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