晏敏︱红柠檬果汁澄清工艺的优化

红柠檬果汁澄清工艺的优化

晏敏，周宇，贺肖寒，梅明鑫，董全*

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

摘 要 选用红柠檬作为研究对象，以透光率为指标来研究果胶酶、复合酶、壳聚糖、膨润土和硅藻土这5种澄清剂对红柠檬汁的澄清效果，并探讨其中澄清效果较好的澄清剂对澄清后果汁品质的影响。通过单因素试验和Box-Behnken试验设计对红柠檬汁澄清工艺进行优化。结果表明，膨润土和硅藻土对红柠檬汁几乎没有澄清作用，果胶酶、复合酶和壳聚糖澄清效果都比较好。综合经济、方便和澄清后红柠檬汁品质3个方面考虑，最后选择果胶酶作为红柠檬汁的澄清剂。利用响应面优化试验得到了澄清型红柠檬汁的最优工艺，其条件为果胶酶用量0.22 g/100mL、处理温度50.3 ℃、pH 4.3和时间62 min，在此条件下，红柠檬汁透光率为93.8%。

关键词 红柠檬；澄清剂；果汁品质；响应面；果胶酶

柠檬为芸香科常绿小乔木[1]。营养价值高，含有大量的柠檬酸、VC、柠檬苦素和柚皮苷等[2]，具有提高免疫力、预防坏血病[3]、降低血压[4]、降血脂[5]和美容等多种功效，其皮和果肉的利用价值高。红柠檬是原产自地中海流域的柠檬品种。红柠檬果实颜色艳丽，皮薄多汁，出汁率达65%以上[6]。红柠檬不仅美味，而且具有抗氧化能力，有益于身体健康，将其制作成澄清果汁可以满足消费者的需求，同时也拓宽了红柠檬的销售市场。而果胶丰富的果汁需要进行澄清处理，澄清工艺对于保证果汁稳定性、延长贮藏期和提高果汁感官品质等方面具有重要作用。新鲜果汁中的混浊主要是由聚合物如果胶物质，半纤维素，纤维素，木质素和淀粉，以及一些化合物如多酚，蛋白质，单宁和金属引起的[7-9]。这些物质需要降解成小分子或者将其去除，以制造清亮和稳定性好的果汁。本研究采用果胶酶、复合酶(果胶酶与纤维素酶复配)、壳聚糖、膨润土和硅藻土5种澄清剂对红柠檬汁进行澄清处理，研究这5种澄清剂的处理效果，以期得到红柠檬汁的最优澄清工艺条件，为澄清红柠檬汁的加工提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红柠檬由重庆上田生态农业开发有限公司提供，榨汁后冷冻。

纤维素酶(酶活力为3 U/mg)、半乳糖醛酸,北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖(生化试剂),国药集团化学试剂有限公司；膨润土(分析纯)、次甲基蓝,天津市大茂化学试剂厂；硅藻土(化学纯)、果胶酶(生化试剂，酶活力为500 000 U/g)、偏磷酸、NaHCO3、2,6-二氯靛酚、NaOH、葡萄糖、CuSO4、酒石酸钾钠、无水乙醇、KH2PO4、Na2CO3、邻苯二甲酸氢钾、抗坏血酸、乙酸(分析纯),成都市科龙化工试剂厂；HCl、H2SO4(分析纯),重庆川东化工有限公司；咔唑(纯度98%),阿达玛斯试剂有限公司；甲醛(分析纯),重庆吉元化学有限公司。

1.2 仪器与设备

722G可见光分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅、THZ-82恒温振荡器,常州智博睿仪器制造有限公司； FA2004A精密型电子天平,上海精天电子仪器有限公司；E-201-CpH复合电极,上海仪电科学仪器股份有限公司；手持折光仪,杭州联测自动化技术有限公司；Centrifuge 5810R型台式低温离心机,德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 红柠檬澄清工艺流程

原料→选果→洗涤→沥干→榨汁→冷冻(-20℃)→解冻(4℃)→粗滤→加澄清剂→沉淀→离心(6 000 r/min离心10 min)→分析上清液[10]。

1.3.2 单因素试验

查相关阅文献,设定红柠檬澄清工艺条件为：(1)果胶酶澄清[11-13]：果胶酶添加量0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/100 mL；pH 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、5.0、5.5；澄清时间 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；澄清温度40、45、50、55、60、65 ℃。加入果胶酶反应结束后需要在80 ℃条件下灭酶2 min，然后再离心测定其透光率。(2)复合酶澄清[14-16]：果胶酶与纤维素酶的质量比1∶1、2∶1 、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1；复合酶用量0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/100mL；pH 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、5.0、5.5；澄清时间 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；澄清温度35、40、45、50、55、60 ℃。加入复合酶反应结束后需要在80 ℃条件下灭酶2 min，然后再离心测定其透光率。(3)壳聚糖法澄清[17]：用量0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/L；澄清时间20、40、60、80、100、120 min；澄清温度20、30、40、50、60、70 ℃ ；pH 2.5、3.0、 3.5、 4.0、 4.5、5.0。(4)膨润土澄清[18-19]:用量1、2、3、4、5、6 g/L；澄清时间5、10、15、20、25、30 min；澄清温度35、40、45、50、55、60 ℃。(5)硅藻土澄清[20]：用量1、2、3、4、5、6 g/L；澄清时间5、10、15、20、25、30 min；澄清温度35、40、45、50、55、60 ℃ 。

1.3.3 指标的测定

澄清度：采用分光光度计进行红柠檬汁的测定，以零杯作为参比，比色杯为1 cm，在适宜的波长下测红柠檬汁的透光率，用透光率T%表示红柠檬汁的澄清度。

波长的确定：取一定量的红柠檬原汁，过滤后在6 000 r/min的条件下离心10 min。取其上清液用分光光度计测定波长在500～800 nm的透光率。

果胶含量的测定——NY/T2016—2011 ；

可溶性固形物含量的测定——NY/T2637—2014；

可滴定酸含量的测定——GB/T12456—2008；

总糖含量的测定——GB/T15038—2006；

VC含量——GB5009.86—2016。

1.3.4 响应面试验设计

根据单因素试验选出较好的澄清剂果胶酶并确定工艺条件最优范围，再利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Benhnken试验设计原理[21]，对澄清工艺条件进行优化，以得到最佳澄清技术条件。因素水平编码见表1。

表1 果胶酶澄清红柠檬汁响应面试验因素水平表
Table 1 Pectinase clarification red lemon juice response surface test factor level table

2 结果与分析

2.1 红柠檬果汁透光率最适波长的确定

从图1可以看出，在波长717 nm处，红柠檬果汁的透光率最大，之后趋近于平稳，故确定717 nm为测定透光率的最适波长。

图1 测定波长对果汁透光率的影响
Fig.1 Effect of determination wavelength on juice transmittance

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 酶法澄清对红柠檬汁澄清度的影响

由图2可知，在果胶酶用量0.10 g/100mL、澄清时间1.5 h和温度50 ℃；果胶酶与纤维素酶的质量比为1∶1、用量0.10 g/100mL、时间1 h和温度50 ℃的条件下，pH在4～4.5范围内果胶酶和复合酶的澄清效果都较好，在pH为4.5时果胶酶和复合酶的活性都最大，澄清效果最好。pH在4.5～5时，果胶酶澄清效果迅速下降，而复合酶澄清效果缓慢下降并澄清效果较好，说明复合酶使用的pH范围比果胶酶宽。pH较低时会降低酶活性，pH过高则会导致果胶酶失活，使果胶酶失去澄清能力。因此，pH 4.5为果胶酶和复合酶的最佳澄清条件。

图2 pH对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.2 Effect of pH on clarity of red lemon juice

由图3可以看出，在果胶酶pH 4.0、澄清时间1.5 h和温度50 ℃；果胶酶与纤维素酶的质量比为1∶1、pH 4.0、时间1 h和温度50 ℃的条件下，果胶酶用量在0.05～0.1 g/100mL时透光率急剧上升，用量在0.1～0.2 g/100mL透光率缓慢上升，随后透光率趋于稳定并有所下降。这是因为果胶酶添加量少时，不能将果汁中的果胶酶有效地分解；果胶酶过量，则会有部分将溶解在果汁里造成透光率下降。复合酶用量低于0.2 g/100mL时，澄清度随着用量的增加而急剧上升，高于0.2 g/100mL时，澄清度有所下降，这可能是由多余的复合酶溶解于果汁中造成的，并且还会增加澄清的成本。因此，果胶酶和复合酶用量都选择0.2 g/100mL左右较好。

图3 用量对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.3 Effect of dosage on clarity of red lemon juice

由图4可知，在果胶酶用量0.10 g/100mL、pH 4.0和温度50 ℃；果胶酶与纤维素酶的质量比为1∶1、用量0.10 g/100mL、pH 4.0和温度50 ℃的条件下，时间在0.5～1 h，果胶酶和复合酶的澄清效果随着时间的延长迅速变好，这是因为时间太短酶与底物反应不完全。时间超过1h后，澄清度先下降随后趋于平稳，这可能是因为果汁营养丰富，时间过长会有微生物污染引起浑浊。因此，果胶酶和复合酶的澄清时间应选择1 h左右。由图5可知，在果胶酶用量0.10 g/100mL、pH 4.0和时间1.5 h；果胶酶与纤维素酶的质量比为1∶1、用量0.10 g/100mL、pH 4.0和时间1.0 h的条件下，果胶酶的最适温度为50 ℃，温度低会抑制酶的活性，温度过高则会破坏果胶酶结构，导致澄清效果不好。复合酶温度在40～45 ℃澄清效果较好，考虑到能源的节约，选择40 ℃作为最佳条件。由图6可知，复合酶用量0.10 g/100mL、时间1.0 h、pH 4.0和温度50 ℃的条件下，果胶酶与纤维素酶的最佳质量比为3∶1左右，果胶酶所占比例过大或过小都会影响澄清效果。

图4 时间对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.4 The effect of time on the clarity of red lemon juice

图5 温度对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.5 Effect of temperature on clarity of red lemon juice

图6 复合酶比例对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.6 Effect of compound enzyme ratio on clarity of red lemon juice

2.2.2 壳聚糖澄清对红柠檬汁澄清度的影响

在澄清时间为60 min、温度40℃和pH 3.5的条件下，由图7可以看出，壳聚糖用量低于1.25 g/L时，果汁澄清度随着用量的增加而上升，这是因为果汁中的大分子物质与壳聚糖结合成絮凝沉淀物更充分。而壳聚糖用量高于1.25 g/L时，果汁澄清度有所下降，这是因为壳聚糖过量引起的果汁浑浊。因此，壳聚糖用量选择1.25 g/L，这时的澄清效果最好。由图8可知，在壳聚糖用量1.0 g/L、温度40℃和pH 3.5的情况下，澄清度随着时间延长而缓慢上升，这是由于壳聚糖与红柠檬果汁中果胶等带负电荷物质相互作用，产生絮凝沉淀物的沉降速度有限，沉降需要一定的时间[22]。但时间超过100 min后澄清度逐渐下降，絮凝沉淀物在果汁中停留时间过长，会造成沉淀物的部分重新溶解，导致沉淀物减少，果汁透光率降低[23]。因此，时间选择100 min时澄清效果最佳。

图7 壳聚糖用量对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.7 Effect of chitosan dosage on clarity of red lemon juice

图8 澄清时间对澄清度的影响
Fig.8 Clarifies the effect of time on clarity

由图9可知，在壳聚糖用量1.0 g/L、澄清时间为60 min和温度40℃的条件下，壳聚糖澄清红柠檬的最佳pH值为3.0，因为壳聚糖分子只能在酸性溶液中缓慢溶解,pH过高时会导致壳聚糖的溶解度降低,同样也会影响其降解效果。由图10可知，在壳聚糖用量1.0 g/L、澄清时间为60 min和pH 3.5的条件下，温度低于60 ℃时，随着温度的升高透光率逐渐增大，这是因为温度的升高会加快分子的扩散速度，有利于壳聚糖与之结合。当温度高于60 ℃时，透光率随着温度的升高而减小，可能是因为温度过高造成絮凝沉淀物的部分重新溶解,最终引起柠檬汁透光率下降[24]。因此，澄清温度在60 ℃时澄清效果最好。

图9 pH对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.9 Effect of pH on clarity of red lemon juice

图10 澄清温度对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.10 shows the effect of clarification on the clarity of red lemon juice

2.2.3 膨润土和硅藻土对红柠檬汁澄清度的影响

在澄清时间都为15 min和温度45 ℃的条件下研究膨润土和硅藻土用量对红柠檬汁的澄清效果；膨润土和硅藻土的用量都为3 g/L和温度45 ℃的条件下研究时间对红柠檬汁的澄清效果；膨润土和硅藻土的用量都为3 g/L和时间为15 min的条件下温度对红柠檬汁的澄清效果，结果见图11～图13，由图11～图13可以看出虽然膨润土和硅藻土的用量，时间和温度对红柠檬汁的澄清效果有所影响，但是总的来说膨润土和硅藻土的澄清效果都不好。透光率与原果汁透光率相近，对红柠檬汁几乎没有澄清效果。

图11 时间对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.11 The effect of time on the clarity of red lemon juice

图12 温度对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.12 Effect of temperature on clarity of red lemon juice

图13 膨润土和硅藻土用量对红柠檬汁澄清度的影响
Fig.13 Effect of dosage on clarity of red lemon juice

根据以上单因素试验结果可以了解到果胶酶、复合酶和壳聚糖的澄清效果好，其中果胶酶和壳聚糖使用方便并且相对更经济。虽然复合酶作用的适宜pH为4.0～5.0，温度为40℃～65℃；果胶酶的适宜pH为4.0～4.5，温度为35℃～55℃，复合酶作用的适宜pH范围更广也更耐高温。但果胶酶适宜pH范围能够满足红柠檬汁澄清工艺的要求；并且在果汁加工中高温对果汁品质会有影响，选择低温条件对果汁加工更有利。果胶酶使用方便，复合酶使用前需要按比例复配，且价格较高。因此，在复合酶和果胶酶效果类似的情况下选择果胶酶对红柠檬果汁进行澄清处理。为了选择一种澄清效果好并能很好地保持红柠檬原有营养品质的澄清工艺，接下来将会进一步研究果胶酶和壳聚糖澄清对红柠檬汁品质的影响。

2.3 澄清工艺对红柠檬品质的影响

由表2可以看出，果胶酶和壳聚糖对红柠檬汁的澄清效果相当，果胶酶澄清对Vc和总糖的保留率更高，壳聚糖对可溶性固形物、总酸和果胶的保留率更高。总酸和果胶含量高不利于后期的加工和贮藏，酸度过高也会影响红柠檬汁的口感，因此，选择果胶酶对红柠檬汁进行澄清处理。

2.4 响应面优化设计结果

2.4.1 响应面多元回归模型的建立与分析

根据单因素试验结果，进行设计4因素3水平的响应面试验，试验设计方案及结果见表3。运用Design-Expert 8.0软件对表3中的数据进行多元回归拟合，得到红柠檬汁澄清工艺参数的二次回归方程为：

Y=-1 861.56-428.10A+124.34B+17.71C+697.99D+75.00AB+2.00AC+136.00AD-2.04BC+3.70BD-1.51CD-776.00A2-25.61B2-0.09C2-76.71D2。

表2 各项指标测定结果
Table 2 Indicators of the determination of the results

表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface Box-Behnken design arrangement and experimental results

对二次回归方程进行方差分析和回归模型系数显著性检验，结果见表4。结果显示模型的显著性水平p<0.000 1，表明该二次方程模型极为显著；同时，失拟项 p>0.05，表明差异不显著，说明残差均由随机误差引起，建立的回归模型能够较好地拟合果胶酶添加量、pH、时间及温度对红柠檬汁透光率的影响情况。该方程的多元相关系数R2为0.998 8，说明该模型与实际拟合较好。

表4 实验结果回归模型方差分析
Table 4 Experimental results regression model variance analysis

注：*，p<0.05，差异显著；**，p<0.01，差异极显著。

2.4.2 果胶酶澄清红柠檬汁的响应面分析

等高线的形状能反映因素之间交互作用的强弱大小，形状越圆说明两因素之间的交互作用越不显著，而形状为椭圆形则表示该交互作用显著[25]。由回归方程系数显著性检验(表4)可知用量和温度之间的交互效应不显著，其他因素之间都有显著的交互作用。交互作用的响应面图见图14。

图14 两因素交互作用对透光率的影响响应面图
Fig.14 Effect of two factors on the transmittance response

2.4.3 果胶酶澄清红柠檬汁响应面试验模型的验证

利用模型得到果胶酶澄清红柠檬汁的最佳工艺条件为加酶量0.22 g/100mL、时间1.04 h、温度50.32 ℃、pH 4.27，预测透光率为94.30%。为了验证回归模型的有效性，根据实际操作的方便性，将最佳工艺条件调整为加酶量0.22 g/100 mL、时间62 min、温度50.3 ℃、pH 4.3，在此条件下进行验证试验得到的透光率为93.8%，结果表明实际测量值接近预测值，说明此回归模型有效。本实验的研究结果与李素清等[10]用果胶酶对青柠汁进行澄清处理的研究结果基本一致。

3 结论

使用果胶酶、复合酶、壳聚糖、膨润土和硅藻土这5种澄清剂对红柠檬进行澄清处理。通过单因素实验可以了解到膨润土和硅藻土对红柠檬汁几乎没有澄清作用，透光率只有2.5%左右，果胶酶、复合酶和壳聚糖澄清效果较好，透光率能达到89%左右。其中果胶酶相对较便宜、使用方便并能较好地保持红柠檬品质，因此，采用响应面分析法进一步对果胶酶澄清红柠檬汁的工艺进行了优化，得到最优工艺条件为加酶量0.22 g/100mL、时间62 min、温度50.3 ℃、pH 4.3，在此条件下进行验证试验得到透光率为93.8%，与理论值的相对误差仅为0. 53% 。结果表明实际测量值接近预测值，此二次回归模型拟合度良好，可以用于指导红柠檬澄清汁的生产。关于澄清操作对红柠檬风味物质的影响，有待于进一步研究。

Optimization of clarification process of red lemons juice

YAN Min, ZHOU Yu, HE Xiao-han, MEI Ming-xin, DONG Quan*

(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

ABSTRACT In this paper, red lemons were used as the main material, the clarification effects of pectinase, complex enzyme, chitosan, bentonite and diatomite on the red lemon juice were studied with light transmittance as the index. The best clarifying agent for the fruit juice was selected. According to single-factor experiments and Box-Behnken experimental design, the optimized clarification process of red lemon juice was obtained. The results showed enzyme and chitosan were better in the clarifying process of the juice. In contrast, bentonite and diatomaceous earth had little effects. Considering the economy, convenience and clarification of the quality of red lemon juice, pectinase was selected a clarifying agent for red lemon juice. The optimum conditions of clarified red lemon juice were: 0.22 g/100mL pectinase, at 50.3 ℃ with pH 4.3 for 62 min, the red lemon juice transmittance was as high as 93.8%.

Key words red lemons; clarifier; fruit juice quality; response surface; pectinase

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.016031

引用格式：晏敏，周宇，贺肖寒,等.红柠檬果汁澄清工艺的优化[J].食品与发酵工业,2018,44(8):224-230.

YAN Min, ZHOU Yu, HE Xiao-han,et al.Optimization of clarification process of red lemons juice[J].Food and Fermentation Industries,2018,44(8):224-230.

第一作者：硕士研究生(董全教授为通讯作者，E-mail：[e-mail])。