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全心全意就为医生服务，一心一意只为造福医生 CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞活性和增殖检测是医学研究中常用的实验技术，其原理是该试剂中含有WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。以下是CCK-8检测的具体步骤： 细胞活性检测 1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。 2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。 3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。 细胞增殖 -毒性检测 1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。 2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。 3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。 4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。 5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 制作标准曲线 1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间)。 |
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