简介 清洁验证是文件化的证据来证明清洁程序的有效性，能有效去除产品残留物，降解产物，防腐剂，赋形剂，和/或清洁剂，以及控制潜在的微生物污染物。清洁验证有助于避免多产品共用设备生产的交叉污染，进而确保药品的质量和安全性。 如果各种活性药物成分或产品是在相同的设备中制造的，并用相同的方法清洗设备，这就允许只选择最关键的物质来执行清洁验证。这种选择，被称为最差情况场景，应基于药物的溶解度，设备清洁的困难程度，生产线中的产品占用情况，和毒理学研究。 根据食品药品监督管理局（FDA）指南，可以采用两种通用的取样方法来测试清洁控制：直接使用工具对设备表面进行采样的擦拭技术和间接的采样方法即测试设备淋洗液的方法（淋洗法）。两种方法的结合通常是最理想的，尤其是在某些情况下，设备某些部位不可触及，阻碍了直接表面采样。 残留测试需要测试方法有足够的选择性和灵敏性，能够都痕量分析物做出量化测定。在这种情况下使用超高性能液相色谱（UHPLC）代替传统高效液相色谱（HPLC）显示了一些优势，比如由于色谱峰更尖更高而带来了更高的灵敏度，可靠性和有效性，分析速度也更快。采用UHPLC，由于使用流通池体积较小的检测器，并且在通过更小粒径的色谱柱时带来的频带扩展，使得选择性得以提高。 糠酸莫米松（图1）是一种合成的皮质类固醇，用于治疗成人和儿童的过敏性鼻炎，和12岁以上的持续性哮喘患者，以及鼻息肉和皮肤病。糠酸莫米松是强效的亲脂性药物，在水和水相溶液中溶解度低。 已经报道过很多定量测试方法来检测糠酸莫米松的含量，这些方法包括测试原料中，制剂中或复方制剂中，以及生物基质，例如人体血浆，组织和支气管肺泡灌洗液中的糠酸莫米松的含量。为了能够定量测试，用到了多种分析技术，比如：薄层色谱（TLC），分光光度法，HPLC和液相色谱-质谱联用（LC-MS）。不过，一项文献调查发现，只有一种经过验证的糠酸莫米松清洁方法。 由于糠酸莫米他松的水溶性低，选择其干粉吸入制剂中作为药品生产线清洁验证的最差情况。本研究的目标是开发并验证一种快速，简单，和有选择性的UHPLC方法来测定糠酸莫米他松残留物已确认其清洁程序的有效性。 原料和方法 试剂和标准： 糠酸莫米松参考标准品：由美国药典USP（美国罗克维尔）提供； 200µg剂量的糠酸莫米松干粉吸入胶囊，和安慰剂：由巴西Mantecorp制药公司提供； 乙腈（ACN）和乙醇等化学品：由默克（Darmstadt，德国）提供； 纯化水：由Milli-Q系统（密理博，米尔福德，马萨诸塞州）制备； 样品提取回收率：使用Alpha Swab聚酯在丙烯手柄TX714A（ITW Texwipe，新泽西州）和AISI 316不锈钢标准板（25cm2和100cm2）进行采样。这些表面可以模拟设备的表面。 流动相和提取溶液的配制：混合500mL的乙腈ACN和500mL的纯化水。混合后的流动相通过0.22µm滤膜过滤并在使用前脱气。提取液是乙醇，因为糠酸莫米松是一种疏水性药物，几乎不溶于水。 仪器和测试条件： 使用 Waters Acquity UPLC H-Class系统（美国马萨诸塞州米尔福德），配置了四元溶剂管理器，自动进样器，柱温箱和光电二极管阵列检测器。软件Empower 3用于数据采集和分析。在Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（50 × 2.1mm，1.8µm）上进行分离。经过优化后，将该柱保持在40℃，使用流速为0.5 mL / min的洗脱液等度淋洗。进样量为2µL，在紫外线（UV）检测器254nm下做检测。 不锈钢板上的样品回收率 擦拭方法：准备50µg/ml浓度的糠酸莫米松样品储备溶液，从40粒胶囊的平均重量来计算，溶解相当于5mg的糠酸莫米他松于100 mL乙醇中。选定不锈钢的表面（5cm×5cm），预先洗净晾干，喷涂1mL的样品储备溶液，也可以喷涂溶剂，在室温下置于通风橱中蒸发过夜。使用预先用萃取剂浸润过的聚酯棉签进行采样。用棉签在板上以锯齿形从右向左，返回时从左到右，再从上到下，然后返回的时候从下到上。为了回收从板中擦下来的残留物，将取样棉签浸入25 mL的萃取溶液，把该药签溶液在超声浴中超声20分钟。然后把这个溶液过滤，进样到色谱系统。回收样品的理论浓度为2µg/ml的糠酸莫米松。 淋洗方法：准备200µg/ml浓度的糠酸莫米松样品储备溶液，从40粒胶囊的平均重量来计算，溶解相当于5mg的糠酸莫米他松于25mL乙醇中。选定不锈钢的表面（10cm×10cm），预先洗净晾干，喷涂1mL的样品储备溶液，也可以喷涂溶剂，在室温下置于通风橱中蒸发过夜。晾干后，用装有100ml萃取液的洗瓶，淋洗板，把萃取液收集到250ml的烧杯中。把这个溶液转移到洗瓶中，再用相同的方法淋洗板两次。最后得到的淋洗液在超声浴中超声20分钟。然后把这个溶液过滤，进样到色谱系统。回收样品的理论浓度为2µg/ml的糠酸莫米松。 方法验证：该分析方法依据巴西立法RDC N°166/2017（26）-方法论和ICH指南Q2（R1）- 分析程序的验证这两个指南文件中描述的建议来进行验证。一些验收标准是根据《标准方法性能要求》的指南来建立的，该方法验证评估了这些参数：选择性，检测限（LOD）和定量限（LOQ），线性，精密度，准确性，耐用性和溶液稳定性。 选择性：通过进样糠酸莫米他松标准品，从不锈钢板中回收的样品溶液，背景控制溶液，和擦拭阴性控制溶液，来评价方法的选择性。背景控制溶液的制备方法和样品回收溶液的制备方法相同，只是喷涂到板上的萃取液不包含样品。擦拭阴性控制溶液只是用棉签浸于萃取液中，但是棉签不接触选定的不锈钢板。安慰剂溶液参照样品溶液的配制方法制备，安慰剂溶液和萃取溶液都进行进样，以确保安慰剂和萃取溶液没有干扰糠酸莫米松的测定。在色谱图中评估糠酸莫米他松的保留时间处是否存在干扰物，可接受标准是色谱峰互相分离，分离度> 2.0。而且，峰纯度由光电二极管阵列检测器来做分析确定。 LOD和LOQ：定量限和检测限分别按照ICH指南信噪比3：1和10：1的原则来评价。使用稀释浓度的溶液来测定。 线性：线性由工作浓度（2µg / mL）的10％至130％溶液来评价。制备七个不同浓度的溶液，每个浓度制备3份溶液。对获得的数据进行统计分析以证明它们符合线性回归。使用Grubbs测试来评估异常值的存在。采用Shapiro-Wilk和Cochran测试方法来评估正态和残差的均方差。此外，也评价了线性回归的显著性和对线性模型的调整。 精密度：当天的精密度由6个平行配制的回收样品溶液来评价，包括擦拭方法和淋洗方法的各自6和溶液。隔天的精密度，通过另一个分析员在另外一天做重复的测试来评估。样品配制溶液用相同的方法，用相对标准偏差RSD来评估和汇报检测结果。 精确度：为了评估准确性，在安慰剂中加入三个已知浓度的糠酸莫米他松对照品：即工作浓度（2µg/ml）的10％，70％和130％的浓度。如所述方法，制备从不锈钢板的回收样品溶液，每个浓度的溶液平行制备三份，计算糠酸莫米他松的回收率。 耐用性：选用精密度测试的样品来评价其耐用性。分别在正常的操作条件下和调整分析参数的条件下进行测试，按照如下条件调整参数变量：柱温（38°C和42°C），流速（0.4和0.6mL / min），流动相组成（48:52和52：48，v / v）和不同批次的色谱柱。每一种色谱条件下，都要进样标准溶液5针，以评价系统适用性参数，包括保留因子，拖尾因子和理论塔板数。 溶液稳定性：使用精密度测试项下的标准溶液和样品溶液，用琥珀色玻璃小瓶装载测试溶液，密封防止溶剂挥发，并把溶液置于自动进样器中，设置4°C。用UHPLC色谱系统测试放置了不同时间段的溶液（0h，24h，48h和72h）。
可接受限度的计算：尽管在当前法规中未建立设备中残留物的可接受限度，FDA声明该限度的制定应基于逻辑标准，例如结合药品质量和安全性相关的风险。此外，限度应该是有实际意义的，可实现和可验证的。 糠酸莫米他松的可接受限度，是基于总生产线设备的面积，疗效的最低治疗剂量，最大每日剂量和所生产批次的大小来计算。模拟的标准样品不锈钢板取样面积分别是擦拭法25cm2，淋洗法100cm2。因此，两种取样方法单位面积的计算限度都是2µg/cm2。 方法的优化 该研究的主要目的是开发UHPLC-UV，等度模式下运行的方法，来测试擦拭样品和淋洗样品中的糠酸莫米他松残留量，并且不受棉签杂质，不锈钢板和萃取媒介的干扰。 为了优化分析方法，选用不锈钢板上回收的擦拭样品，用不同的色谱柱进行测试，最后发现Waters的Acquity UPLC HSS T3色谱柱（50×2.1mm，1.8µm）获得了最好的检测结果，色谱柱温的研究在25°C至40℃范围，随着温度的升高，峰形和灵敏度得到改善。因此，色谱柱温设定在40℃。流动相中的水量在40％ - 60％调整，流速在0.3mL / min至0.8mL / min之间调整。最后，在以下条件获得了适当的分离度，拖尾因子和理论塔板数：流动相（ACN：纯化水，1：1，v/v）, 流速为0.5 mL/min。考虑到分析物是中性和非离子化合物（pKa值为13.8），流动相中没有使用添加剂。选择的波长为254 nm，糠酸莫米他松在此波长显示出良好的吸收。
图-2：色谱图分别来自试液：
表I 糠酸莫米他松精密度测试（平均值+/-标准偏差） 准确性：在安慰剂中加入三个已知浓度的糠酸莫米他松对照品来评估准确性。 表II 糠酸莫米他松回收率测试（平均值+/-标准偏差，n=3） 耐用性：在耐用性研究中，每个所选的色谱因子逐一改变以进行估计改变对结果的影响。方法对于所有拟定的改变都耐受，因为在测试清洁验证样品中，没有观察到对糠酸莫米他松的定量测定的显著不同。 溶液稳定性：和初始实际的结果对比，所有测试样品的面积变化<2%。因此，可以认为测试溶液在72h内都是稳定的，在这个时间段内都没有观察到降解产物。 结论： 本研究开发并验证了一个UHPLC-UV方法来测定药物生产线清洁后的糠酸莫米他松残留。该方法具有选择性，因为安慰剂，溶剂和其他物质都没有对测试产生干扰。擦拭取样程序和淋洗取样程序都经过了优化，使用乙醇作为萃取溶剂，以获得有效的高回收率。该方法经过了全验证，验证了其选择性，线性，精密度，精确度，和耐用性，验证确认该方法对于清洁程序残留检测的有效性。 |
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