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甲氨蝶呤（MTX）联合来氟米特（LEF）能有效治疗难治性RA，对于这一现象，意大利热那亚大学的Cutolo等人进行了深入研究，他们通过对来自类风湿关节炎（RA）患者的滑膜巨噬细胞与激活的T细胞系进行共培养，进一步解释了MTX联合LEF治疗难治性RA的机制。 研究者采集了5名RA患者的滑膜液，从中分离出滑膜巨噬细胞，之后与激活的T细胞进行共培养。然后，对共培养的细胞进行了药物处理，分别用LEF单药（1 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L）以及LEF联合MTX 50 ng/ml作用于细胞。最后，分别通过免疫细胞化学法（ICC）、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法（ELISA）及RT-MPCR对细胞和培养液中的促炎细胞因子（TNFα、IL-1β、IL-6）、黏附因子ICAM-1、环氧酶同工酶（COX1、COX2）及NF-κB等进行了细胞内外蛋白水平及mRNA水平的检测。 结果显示，对于LEF单药（1 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L）处理，运用ICC法定量检测，相比未处理的细胞（对照组），TNFα分别下降13%、24%和40%，IL-1β分别下降16%、39%和58%，IL-6的下降呈非剂量依赖性，分别下降46%、43%和44%；当联合MTX后，下降更为明显，相比对照组，TNFα分别下降29%、37%和49%，IL-1β分别下降56%、43%和50%，IL-6分别下降59%、62%和71%。ELISA法也显示，LEF + MTX处理后细胞因子水平显著下降（TNFα 40%、41%、44%；IL1β 10%、20%、60%；IL-6 37%、41%、49%）。蛋白质印迹法和RT-MPCR法证实了这些结果。在LEF + MTX处理后也观察到ICAM-1、COX1、COX2和NF-κB的表达水平下降。NF-κB在通过LEF单药（1 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L）处理后，RT-MPCR结果显示其mRNA凝胶电泳条带均消失，在联合MTX后，同样均未显示条带。 这项发表在《风湿病年鉴》杂志上的研究，证明了MTX联合LEF治疗RA的协同作用，在两药联合后，对炎症因子（TNFα、IL-1β、IL-6）、黏附因子ICAM-1等具有更为显著的抑制作用，两药良好的协同效应，从机制上解释了MTX联合LEF方案有效治疗难治性RA的原因。 Annals of the Rheumatic Diseases 2006;65:728-735
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