一步搞定基因定点突变引物设计，3天拿到突变体——Quickchange

基因定点突变：为了研究某一基因的功能，我们通常不仅需要研究其野生型基因的功能，也需要进一步去挖掘它发挥作用时是哪一个结构域，甚至是哪一个氨基酸发挥了作用。而这里面就涉及到了如何设计定点突变引物的问题，今天为大家介绍一个在线网址--quickchange primer design，可以非常方便快捷为我们设计出合适的引物。

你可以直接百度搜索quickchange或者输入https://www./store/primerDesignProgram.jsp就可以进入到该网站的主页面。

该网站可以设计单点和多点突变引物以及删除或者插入一段DNA序列（ 插入时只能插入小的DNA片段）。我们今天着重讲解如何利用该网站设计引物，并利用该引物构建出我们想要的突变体。

如果我们实验室又穷，又不想买突变试剂盒怎么办？我们可以不用管第2步，默认其设置，不用试剂盒也可以构建出我们想要的突变体。

第3个选项输入我们的DNA序列，既可以通过Browse选项上传已经下载好的序列，也可以直接粘贴文本格式或FASTA格式的DNA序列。第4步将DNA序列转换成蛋白序列（Upload Translated）。下面我们以人的TP53基因为例进行演示：

首先我们从NCBI上下载TP53基因序列，将其粘贴到相应选项框内，并转换为氨基酸序列，如下图：

同时我们也会看到多出来的选项5，如果我们要进行点突变，则需要勾选5后面的灰色圆圈

在下面这个框选中我们要突变的目的氨基酸，如红色圆圈标出所示：

同时在下面选框勾选出我们想要突变成的氨基酸，这个就表示我们将N29突变为I（N29I），S33突变为K (S33K)，L35突变为E (L35E)，E55突变为C (E55C)

该网站可以同时设计针对7个氨基酸的突变引物,接下来点击Primer Design即可得到引物序列：

同时也能看到对应引物的长度及其相应的Tm值：

也能看到引物与模板相互匹配的序列：

接下来我们再讲如何删掉一段DNA序列，同样我们选择or下面的小圆框，选中两个氨基酸，即可设计出删掉这两个氨基酸之间片段的引物（注意：这两个氨基酸不会被删除）。

比如我们想删掉第29个氨基酸和第51个氨基酸之间的片段，我们可选中29N和51E即可，如下图

依旧点击Primer Design即可设计出引物，且能看到引物与模板之间的配对情况。

好了，是不是感觉定点突变的引物设计很简单呢？接下来，我们拿到引物就可以进行突变体构建了。

1.如下是我的PCR反应体系：

Template:  200ng (XμL)

Forward primer：1μL

Reverse primer：1μL

5*reaction buffer：10μL

2.5mmdNTPs：4μL

Pfu DNA polymerase：1μL

Nuclease-free water：up to 50 μL

2. 然后就按照你所买的DNA高保真酶（PCR Enzyme）的说明书设置PCR反应条件，我一般设置30个循环。

3. PCR反应结束后，直接加入Dpn I 限制性内切酶（待突变的质粒在细菌中会被甲基化修饰，因此，用Dpn I可以消化掉相应的模板质粒，而使突变质粒保留下来）及相应的buffer，37℃酶切反应1h左右(也可相应的缩短或延长酶切反应时间)。

4.直接用DNA回收试剂盒进行胶回收，根据浓度，取100ng进行转化，涂平板。

5. 第二天即可挑取单菌落送测序。

6.随后将测序正确的样品提质粒，即可进行后续相关实验。

有没有觉得点突变很简单呢？如果你正在进行相关实验，不妨试一试。

注：个人经验，一般单点突变成功率较高，可达100%。在进行多点突变时可将多对引物放在一个PCR反应体系中进行，但相应的效率也会降低。笔者做过同时突变两个点和四个点，将突变引物全部加到一个体系中，阳性率在25%~60%之间不等。

封面图来源于网络

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