【原】科研 | Science Immunology：Kai Kessenbrock等通过单细胞转录组学确定乳腺癌中髓样抑制细胞的出现

转录组 2021-04-20

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编译：小鹿同学，编辑：十九、江舜尧。

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骨髓衍生抑制细胞（MDSCs）是先天性免疫细胞，具有抑制癌症期间适应性免疫反应的能力。目前尚不清楚MDSCs与正常髓样对应物有何区别，这限制了人们在癌症期间对靶标MDSCs的特异性检查和治疗的能力。本文中，研究者基于MMTV- PyMT小鼠模型确定了与乳腺癌相关的MDSCs分子特征，接着使用单细胞RNA测序比较来自荷瘤小鼠和野生型小鼠包含MDSC的脾脏髓样细胞。通过对14,646个单细胞转录组数据的计算分析显示，MDSCs通过脾脏内中性粒细胞成熟的异常轨迹而出现，从而赋予它们免疫抑制性的细胞状态。研究者确定了MDSC-特异性基因标记，并将CD84鉴定为表面标记物，从而改善乳腺癌中MDSCs的检测和富集。

论文ID

原名：Defining the emergence of myeloid-derived suppressor cells in breast cancer using single-cell transcriptomics

译名：使用单细胞转录组学确定乳腺癌中髓样抑制细胞的出现

期刊：Science Immunology

IF：10.551

发表时间：2020年2月21日

通讯作者：Kai Kessenbrock

通讯作者单位：美国加州大学欧文分校生物化学系

DOI号：10.1126/sciimmunol.aay6017

实验设计

本研究的目的是通过单细胞转录组学来定义与癌症-相关的骨髓衍生抑制细胞（MDSCs）的分子特征。为此，研究者分析了最常用且能够形成MDSC的乳腺癌小鼠模型（即MMTV- PyMT）。首先，研究者通过荧光激活细胞分选术（FACS）从荷瘤小鼠和对照小鼠的各个组织中分离出CD11b⁺Gr1⁺细胞对MDSCs的存在进行表征，并对其进行体内T细胞的抑制测定，确定了脾脏为荷瘤小鼠体内MDSCs积累的主要部位。接着，研究者对荷瘤小鼠和对照小鼠（各三只）脾脏中FACS-分离的共14,646个CD11b⁺/Gr1⁺细胞进行了单细胞转录组测序。然后，研究者根据scRNAseq数据对细胞类型聚类进行计算分析，从而鉴定中性粒细胞和单核细胞的起源细胞，并将分析重点集中在荷瘤小鼠体内存在的簇群。同时，研究者在其它荷瘤小鼠和对照小鼠中使用qPCR对MDSC-相关的表达变化进行了正交验证。最后，研究者进行了细胞表面标记的子集分析，从而鉴定出MDSC-特异性细胞表面分子（CD84和JAML），并通过流式细胞术调查、验证了小鼠中已知的粒细胞（Ly6g或CD15）和单核细胞（Ly6c或CD14）的细胞表面标志物，同时研究者利用小鼠骨髓或人外周血样品在体外生成了初级MDSCs，其与体内的MDSCs极其相似。

结果

脾脏是荷瘤小鼠骨髓衍生抑制细胞（MDSCs）积累的主要部位

通过小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子驱动表达多瘤病毒中间T癌蛋白（PyMT）的小鼠形成与人类发病机理极为相似的乳腺肿瘤，并在肿瘤形成期间产生MDSCs。本研究使用患有乳腺癌的MMTV- PyMT转基因小鼠模型来探索MDSCs在乳腺癌进展中的作用。研究者首先寻找MDSCs积累的确切器官位置，从而对该细胞群进行深入的分子研究。与先前在其它小鼠癌症模型中的报道一致，研究者观察到癌症进展的后期与骨髓、血液、脾脏、肺、大脑和原发性肿瘤中CD11b⁺Gr1⁺细胞的扩增有关，并且与野生型（WT）相比，荷瘤PyMT小鼠的脾脏增大。为了在功能上确认MDSCs是否存在于荷瘤小鼠CD11b⁺Gr1⁺细胞的扩增种群中，研究者通过荧光激活细胞分选术（FACS）从荷瘤小鼠和对照小鼠的各个器官中分离出CD11b⁺Gr1⁺细胞，并与分离的T细胞共培养，从而检测CD3/CD28共同刺激引起的T细胞增殖的抑制作用，而活性氧（ROS）的形成作为一个MDSC功能的指示数据。研究者发现从荷瘤小鼠脾脏中分选出的CD11b⁺Gr1⁺细胞显著抑制CD4⁺和CD8⁺细胞的增殖，而来自对照组小鼠脾脏的CD11b⁺Gr1⁺细胞对T细胞增殖并没有可检测到的影响。从荷瘤小鼠骨髓和肺部分选出的CD11b⁺Gr1⁺细胞被证实对T细胞增殖没有显著抑制作用。这些发现被进一步证实了，即通过使用2’,7’-二氯荧光素乙酰乙酸盐（H₂DCFDA）的流式细胞术来检测ROS的产物分析，发现只有来自荷瘤小鼠脾脏的CD11b⁺Gr1⁺细胞表现出显著的氧化迸发形态，并作为MDSCs的标志。总之，这些结果证实了在PyMT小鼠乳腺肿瘤形成过程中，脾脏是MDSC出现的主要部位之一。

单细胞转录组学揭示在中性粒细胞谱系和单核细胞谱系中MDSCs作为独特的簇

为了确定MDSCs在细胞和分子水平上与正常髓样对应物之间的差异，研究者使用单细胞RNA测序（scRNAseq）比较了荷瘤小鼠中脾脏来源的骨髓细胞与野生型小鼠中各自对应细胞群体的分子差异。研究者使用可扩展的液滴介导的scRNAseq平台（10×Genomics Chromium）分析来自荷瘤PyMT小鼠和对照组WT小鼠脾脏中经FACS纯化的（SYTOX-阴性）CD11b⁺Gr1⁺骨髓活细胞（图1A）。研究者分别分析了来自荷瘤PyMT小鼠（9155个细胞）和WT小鼠（5491个细胞）的两个样品，共计14,646个细胞，且每个细胞测序的平均深度约为50,000个读数。使用Cell Ranger pipeline（10×Genomics）将两个库汇总并排列在一起，从而补偿库复杂性的微小差异。经过质量控制过滤从而去除包含较低检测率的基因（＜500个基因）和较高含量的线粒体基因（＞8%）的细胞后，研究者使用Seurat对组合的PyMT和WT数据集进行了聚类分析和细胞类型鉴定分析。通过典型相关分析（CCA）方法，研究者基于骨髓亚群标志基因的表达情况鉴定了主要的细胞类型（图1B），并确定了它们的标志性基因。中性粒细胞形成了最大的细胞群，涵盖了许多不同的簇（C0,C2,C4,C5,C7和C8），这些簇的特征是高水平的Ly6g和Cxcr2表达（图1，B和C）。单核细胞的数量较少，且多样性较低，只形成了一个以Csf1r和Ccr2的表达为标志的簇（C1）（图1，B和C）。研究者还检测了两种次要细胞类型：表达Cd3、Cd4和Cd8的T细胞（C9）和表达Cd19、Cd22和Cd79a的B细胞（C6,C3）（图1，B和C）。

图1. 使用scRNAseq鉴定MDSC-特异性基因表达的特征。（A）对单细胞分析的方法回顾以及CD45⁺CD11b⁺ Gr1⁺细胞（SYTOX蓝-阴性）通过液滴化的scRNAseq后经FACS从对照组WT小鼠和荷瘤PyMT小鼠的脾脏中分选出来。（B和C）tSNE投射图显示了来自对照和PyMT小鼠总共14,646个细胞结合Seurat的分析结果，导致脾脏CD11b⁺Gr1⁺细胞出现明显不同的簇。基于标志基因的表达情况概述了主要细胞类型（T细胞、B细胞、中性粒细胞和单核细胞）。（C）图为四种主要细胞类型特征标记的特征图，显示了从灰色低表达到紫色高表达的表达水平。（D）在C1簇中通过来自PyMT样本中标志基因（Arg2 和Il1β）的表达来鉴定粒细胞-MDSCs（G-MDSCs）。（E）单核细胞簇鉴定单核细胞-MDSCs （M-MDSCs）的亚群分析。发现了三个簇；簇M2被鉴定为M-MDSCs（Arg2 和Il1β阳性）。（F）热图展示了分别与来自WT小鼠的正常中性粒细胞和单核细胞簇相比时，G-MDSC和M-MDSC每个簇中表达最高的标记基因的比例表达模式。黄色：高表达；紫色：低表达。（G）维恩图显示了统计学上显著的标记基因数目以及G-MDSC和M-MDSC之间的重叠。（H）使用Enrichr对挑选的MDSC特征进行基因本体论（GO）术语分析。（I）使用qPCR对挑选的上调MDSC基因进行验证，并使用非成对t检验进行统计学分析（平均值±SEM，n=3），*P<0.05。

对中性粒细胞异质性的进一步调查显示，C0簇的特征是与成熟中性粒细胞状态相关的基因（比如Camp）水平较高，以及Ly6g的高水平表达；C2簇在荷瘤PyMT小鼠中高度富集，并显示出高水平的MDSC-相关基因，比如Arg2 和Il1β，其在先前用于癌症模型中定义MDSC的两个主要免疫抑制因子（图1D）；C4和C5簇显示出重叠的标志基因的表达，包括Cebpe和Retnig等基因；C7和C8簇表现出细胞周期基因的高表达，例如Tuba1b和Cdc20，这表明脾脏中存在中性粒细胞的增殖谱系。

接下来，研究者将重点放在单核细胞-限制性的C1簇，该簇在组合分析中显示出MDSC基因Arg2 和Il1β的弥散表达（图1D），这表明M-MDSCs确实存在，但与单核细胞相比并没有明显的簇群，因为组合分析中不同细胞类型之间应该具有更多实质性的区别。因此，在去除污染细胞（比如中性粒细胞和B细胞）后，研究者针对单核细胞进行了聚类分析从而鉴定出三种不同的状态（簇M0到M2），包括M2簇中的M-MDSC谱系，其在荷瘤PyMT小鼠中高度富集（图1E）。这些分析为接下来的G-MDSC和M-MDSC的详细分子定义奠定了基础。研究者的数据集代表了一个有价值的MDSCs的单细胞水平转录组分析，揭示了G-MDSC和M-MDSC能够形成独特的簇，且它们不同于其正常髓样对应物。

G-和M-MDSC具有与正常骨髓细胞不同的保守免疫细胞激活程序

研究者接着使用scRNAseq数据集揭示MDSCs的独特分子特征，并阐明定义MDSC状态的独特生物学程序。研究者在Seurat中进行了差异表达分析，从而确定来自荷瘤小鼠的G-和M-MDSCs与正常小鼠的髓样对应物（即WT小鼠的中性粒细胞和单核细胞）有何不同（图1F）。研究者的分析显示，与正常中性粒细胞相比，G-MDSCs中有642个差异表达的基因，与正常单核细胞相比，M-MDSCs中有223个差异表达的基因，这表明MDSCs与正常髓样对应物之间的差异很大。G-和M-MDSCs的标记基因之间存在大量重叠（200个高表达标记基因中重叠105个）（图1G），表明单核细胞和中性粒细胞均可独立获得相似的免疫抑制细胞状态。共有的标记基因包括参与免疫抑制的基因，比如Il1β、Arg2、Cd84和Wfdc17。据报道，干扰素诱导的跨膜蛋白1（Ifitm1）参与直肠癌和炎症性乳腺癌细胞的进展，其在MDSCs中被上调。其它MDSC标志基因包括骨髓-相关的免疫球蛋白样受体家族（Cd300ld）、C型凝集素结构域家族4成员E和D（Clec4e和Clec4d）、IL-1f9（Il1f9）、激活蛋白1转录因子亚基（Junb）、组织蛋白酶D（Ctsd）、磷脂酶A2Ⅶ组（Pla2g7）以及含5个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域（BC100530）。

研究者接着使用Enrichr对MDSC基因特征进行基因本体论（GO）术语分析。最普遍的GO术语包括“中性粒细胞介导的免疫”“涉及免疫响应的中性粒细胞激活”以及“中性粒细胞的脱粒”（图1H）。这些术语包括编码补体C5a受体1（C5ar1）、S100钙结合蛋白A11（S100a11）、C型凝集素结构域4成员D（Clec4d）、趋化因子受体2（Cxcr2）和骨髓细胞表明抗原CD33（Cd33）等的基因。正如对C5ar1和S100a11的报道，这些因素中的一些促进中性粒细胞和MDSCs的募集。此外，Cd33在MDSCs中特异性表达，并且目前其作为治疗方法的靶标。另一个明显的GO术语“细胞因子介导的信号传导途径”（图1H）包括Il1β、Ifitm1、Junb和Myd88等基因。据报道，尤其是Myd88可以促进未成熟的Gr1 ⁺细胞扩增，并可能参与介导T细胞-抑制的细胞状态。此外，该途径包括与MDSC积累和运输相关的基因（比如Cxcr2、Csf3r和Ccr1），这表明MDSCs似乎能够响应来自炎症部位（例如原发肿瘤或转移部位）的募集信号。

为了验证MDSC基因标记，研究者通过FACS的方法从WT和荷瘤PyMT小鼠的脾脏中分离出CD11b⁺Gr1⁺细胞，并对其进行定量聚合酶链式反应（qPCR）。研究者的scRNAseq结果在这种靶向方法中得到了广泛的证实，因为与WT小鼠相比，来自PyMT小鼠的CD11b⁺Gr1⁺细胞中MDSC的标记基因在很大比例上出现显著上调（图1I）。总之，这些结果表明G-和M-MDSCs共享一套保守的基因特征，并且其与正常的髓样对应物显著不同。这种共享的MDSC标志基因列表显示了其与先前MDSCs的整体转录组水平分析之间存在某些差异和重叠，因此系统地确定这些骨髓细胞系的整体水平变化是否会掩盖MDSC细胞功能的某些特定程序将十分有趣。

MDSC基因标记在人类乳腺癌相关的中性粒细胞中高表达

为了确定这种MDSC基因标记是否可以推广并转移到人体环境中应用，研究者探索了最近发表的scRNAseq免疫细胞图谱，包括来自乳腺癌患者原发性肿瘤样本中的T细胞、B细胞、单核细胞和中性粒细胞。研究者在Seurat中对该数据集进行了聚类分析以繁殖细胞类型标记（图2A），然后对所有细胞类型进行了无差别的基因标记评分，研究者从中发现，肿瘤微环境中尤其是中性粒细胞和单核细胞内存在MDSC标记基因的高表达（图2B）。为了评估拥有特别高MDSC标记的中性粒细胞是否存在不同子集，研究者对分离的中性粒细胞进行了无差别聚类分析，并产生了四个不同状态的子集（图2，C和D）。N0簇显示了MDSC-相关的标记基因S100A9和CCR2，这表明中性粒细胞的这一亚群代表了乳腺癌患者肿瘤微环境中的G-MDSCs。使用研究者的MDSC基因标记对这些中性粒细胞的子集进行基因得分分析，结果确实显示目前为止N0簇的细胞得分最高（图2E）。此外，研究者对单核细胞进行了单独分析，结果显示对于MDSC标记，三个不同簇之间的得分并不明确（图2，F和H），表明M-MDSCs在小鼠和人类之间可能不具有直接可比性。总之，这些分析证实了，至少在G-MDSCs背景下，研究者从乳腺癌小鼠模型中得到的MDSC基因标记可以转移到人体疾病中应用，这表明MDSC的状态在小鼠和人类之间很大程度上是保守的。

图2. 使用MDSC标记对来自乳腺癌患者的骨髓细胞进行比较分析。（A）对先前发表的scRNAseq数据集进行Seurat分析，该数据集包含经均匀流形近似和投影（UMAP）预测的原发性乳腺肿瘤样品中的各种免疫细胞群，并使用不同颜色来表示细胞类型标记。pDC：浆样树突状细胞；mDC：髓样树突状细胞。（B）小提琴图显示该数据集中所有细胞的相对MDSC得分，当按照细胞类型进行排序时发现中性粒细胞和单核细胞的得分最高。（C）经UMAP单独预测的中性粒细胞进行独立无差别的Seurat聚类分析，从而在该数据集中产生了四种不同的中性粒细胞簇。（D）热图展示了每一个中性粒细胞簇中前10的标记基因。（E）小提琴图展示了按中性粒细胞亚簇排列时的相对MDSC得分，发现0簇展现出MDSC基因标记的最高表达。（F）经UMAP预测的子集进行单核细胞-特异性Seurat聚类分析，从而在该数据集中产生了三个不同的单核细胞簇。（G）热图展示了每一个单核细胞簇中前10的标记基因。（H）小提琴图显示了按照单核细胞亚簇排列时的相对MDSC得分。

用于MDSC鉴定和分离的细胞表面标记的鉴定

研究者的scRNAseq数据揭示了几种先前未知的MDSC的特异性细胞表面标记，包括CD84和Amica1/JAML。CD84是信号传导性淋巴细胞激活分子家族的细胞表面受体，并在某些免疫细胞类型中表达。Amica1/JAML是已知通过与上皮细胞表达的柯萨奇-腺病毒受体（CAR）相互作用从而介导中性粒细胞和单核细胞转运的连接粘附分子。研究者对来自WT和荷瘤PyMT小鼠不同器官的CD11b⁺Gr1⁺细胞使用FACS进行CD84和JAML表达的分析。研究者首先使用荧光减一（FMO）和同型对照以确定特异性标志基因的表达。接着，研究者表征了来自各种器官标本（骨髓、肺、脾脏、乳腺脂肪垫（MFP）和原发性肿瘤）的CD11b⁺Gr1⁺细胞中CD84和JAML的表达，并将对照WT和荷瘤PyMT小鼠进行了比较。尽管来自骨髓和肺的CD11b⁺Gr1⁺细胞通常对CD84（图3A）和JAML（图3D）呈现阴性，但研究者发现与相应的WT对照小鼠相比，来自荷瘤PyMT小鼠脾脏和原发性肿瘤的大量CD11b⁺Gr1⁺细胞表现出CD84（图3B）和JAML（图3E）的高水平表达。当将所有器官的细胞并排绘制时，这一点儿尤为明显（图3，C和F）。脾脏和原发性肿瘤中CD84和JAML的高表达，这一观察结果与这些部位中CD11b⁺Gr1⁺细胞的MDSC高容量有关。

图3. 鉴定乳腺癌模型中MDSCs的细胞表面标志物。（A）WT和荷瘤PyMT小鼠的CD84表达谱显示，只有PyMT小鼠的脾脏和原发性肿瘤（TM）展现出显著表达。SSC-A：侧向散射区域。（B）使用非成对t检验的组合结果和统计分析（平均值±SEM，n=10），*P<0.05。（D）WT和荷瘤PyMT小鼠的JAML表达谱显示，只有PyMT小鼠的脾脏和肿瘤展现出显著表达。（E）使用非成对t检验的组合结果和统计分析（平均值±SEM，n=3），*P<0.05。（C和F）把多个流动样本并置，从而将所有样本在一个特征图中可视化CD84和JAML的表达，其中涵盖来自WT和PyMT小鼠的所有样本，包括FMO、骨髓（BM）、肺、脾脏、MFP和肿瘤。仅在来自PyMT的脾脏和肿瘤中观察到显著表达。（G）外周血单核细胞（PBMC）收集、培养条件和FACS方法的概述。（H）把多个流动样本并置，从而将所有样本在一个特征图中可视化G-和M-MDSCs中CD84的表达，包括PBMC对照组和处理组。（I和J）使用非成对t检验的统计分析（平均值±SEM，n=3），*P<0.05。

为了确定这些标记物的通用性，研究者接着探讨了CD11b⁺Gr1⁺细胞在另外一种乳腺癌小鼠模型中是否表达CD84：一种在Balb/c小鼠中使用4T1乳腺癌细胞的原位移植模型。与MMTV-PyMT模型相似，研究者观察到CD84的表达在4T1荷瘤动物的脾脏（~21.96%）和原发性肿瘤（~8.49%）中提高了，而来自骨髓和肺的CD11b⁺Gr1⁺细胞中未检测到CD84的表达。此外，研究者通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）处理骨髓细胞来进行MDSC的体外生成。研究者发现GM-CSF处理后，CD11b⁺Gr1⁺细胞系中CD84-阳性细胞（~24.45%）和JAML-阳性细胞（~11.26%）均显著增加。最后，研究者使用先前建立的步骤，即通过分离外周血单核细胞（PMBCs）实现人类MDSCs的体外生成，并用GM-CSF和IL-6处理它们（图3G）。研究者观察到与对照组细胞相比，体外生成的CD11b⁺/CD14⁺ M-MDSCs和CD11b ⁺/CD15⁺G-MDSCs的样本中CD84出现显著上调（图3，H到J）。为了进一步验证在这些体外培养基中成功产生了MDSCs，研究者检测了CD11b ⁺/CD15⁺中性粒细胞中凝集素型氧化LDL受体1（LOX-1）（先前被用来定义G-MDSCs）的表达，同时发现在人类中性粒细胞中该G-MDSCs标志物与CD84的上调相关。研究者还检测了培养基内CD11b⁺/CD14⁺单核细胞中人类白细胞抗原-DR（HLA-DR）的表达，该表达已在体内M-MDSCs中下调，同时发现体外产生的M-MDSCs中HLA-DR确实也下调了。总之，这些实验将CD84确立为G-和M-MDSCs的一个可靠且可推广的细胞表面标记。

CD84^hi MDSC具有抑制T细胞和增加ROS产量的作用

为了在功能上验证CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞是否抑制免疫细胞的激活，研究者与之前描述的T细胞进行了共培养（图4A）。荷瘤小鼠脾脏中的CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞显著抑制CD4和CD8 T细胞的增殖，而来自荷瘤小鼠的CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺CD84¹^o细胞并没有明显的抑制作用（图4，B和C）。在原发性肿瘤中，CD84^hi和CD84^lo均表现出T细胞抑制能力（图4，D和E），这似乎表明肿瘤微环境中存在其它因素，这些因素有助于MDSCs的成熟。在与CD84^-^/^lo细胞的直接比较中，CD84^hi表现出更强的免疫抑制作用（图4，D和E）, 这与CD84的表达是MDSC能力的一个有力指标的观点相符。

图4. CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞具有抑制T细胞和增加ROS产量的强大能力。（A）使用来自WT和PyMT小鼠两种不同组织（脾脏和原发性肿瘤）的FACS方法概述，从而进行T细胞激活、ROS形成和qPCR分析。（B和C）来自荷瘤小鼠的脾脏CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞抑制T细胞的增殖。直方叠加图（B）和定量条形图（C）展示了在对照样品中通过FACS检测的CD4/CD8 T细胞的增殖，其中样品包括仅T细胞（黑色）、CD3/CD28激活的T细胞（蓝色）、激活的T细胞+来自对照小鼠脾脏的CD11b⁺Gr1⁺细胞（SPLN）（橙色）、激活的T细胞+ CD11b⁺Gr1⁺CD84^-^/^lo细胞（紫色）以及激活的T细胞+来自荷瘤小鼠脾脏的CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞（红色）。（C）图使用非成对t检验进行统计分析（平均值±SEM，n=3）*P<0.05。（D和E）使用从原发性肿瘤中分离的CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi和CD84^-^/^lo细胞进行T细胞抑制分析。直方叠加图（D）和定量条形图（E）展示了在对照样品中通过FACS检测的CD4/CD8 T细胞的增殖，其中样品包括T细胞（黑色）、CD3/CD28激活的T细胞（蓝色）、激活的T细胞+ CD11b⁺Gr1⁺CD84^-^/^lo细胞（紫色）以及激活的T细胞+来自荷瘤小鼠脾脏的CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞（红色）。（E）图使用非成对t检验进行统计分析（平均值±SEM，n=3）*P<0.05。（F和G）与CD11b⁺Gr1⁺CD84^-^/^lo细胞相比，来自荷瘤小鼠的CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞显示增加了ROS的形成；卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）-处理的细胞作为阳性对照。ROS通过使用H₂DCFDA的FACS来检测。（G）图使用非成对t检验进行ROS鉴定的统计分析（平均值±SEM，n=3）*P<0.05。DCF：2'，7'-二氯荧光素二乙酸盐。ns：不显著。

研究者接下来检测了ROS的产量，并将其作为来自荷瘤小鼠和对照小鼠脾脏和原发性肿瘤的CD11b⁺Gr1⁺CD84^-^/^lo和CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞中MDSC功能的标志。研究者将ROS的H₂DCFDA染色与流式细胞术结合起来使用，观察到与对照小鼠的CD11b⁺Gr1⁺细胞相比，CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞产生的ROS量显著更高，而CD11b⁺Gr1⁺CD84^-^/^lo细胞的ROS产量则没有统计学的差异（图4，F和G）。此外，与CD11b⁺Gr1⁺JAML^-^/^lo细胞和对照组CD11b⁺Gr1⁺细胞相比，来自荷瘤小鼠脾脏和肿瘤的CD11b⁺Gr1⁺JAML^hi细胞中ROS产量显著增加。最后，研究者使用qPCR来调查从MDSC标志物中选定的基因，发现与CD11b⁺Gr1⁺CD84^-^/^lo细胞相比，CD11b⁺Gr1⁺CD84^hi细胞中完整的MDSC相关基因的表达提高。这些发现表明，在CD84高表达的基础上，拥有T细胞抑制和ROS产量能力的MDSC可以被忠实地检测到并被富集。

为了进一步区分MDSCs子集（G-和M-MDSCs）中CD84和JAML的表达，研究者使用流式细胞术结合CD84或JAML染色调查了CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺ Ly6G^-（M-MDSCs）和CD45⁺CD11b⁺Ly6C^lo Ly6G⁺（G-MDSCs）。脾脏的M-MDSCs中CD84的检测率较低，然而与对照乳腺细胞相比，来自原发性肿瘤的M-MDSCs中CD84的表达却显著增加（~28.13%）。另一方面，在荷瘤小鼠的原发性肿瘤（~30.46%）和脾脏（~17.33%）中G-MDSCs均表现出较高的CD84表达。在荷瘤小鼠脾脏和肿瘤的M-和G-MDSCs中JAML的表达均上调。为了进一步验证CD84表达的增加与两个MDSC亚组中的功能性MDSC能力有关，研究者从体外生成的MDSC中分离了Ly6C⁺CD84^hi或Ly6G⁺CD84^hi细胞，并进行了T细胞抑制实验。Ly6C⁺CD84^hi和Ly6G⁺CD84^hi细胞抑制CD4和CD8 T细胞增殖的程度与研究者先前在组合的CD11b⁺/Gr1⁺细胞系中发现的程度相似。这些发现表明，G-和M-MDSCs两个亚组同时表达CD84和JAML，并且能够抑制T细胞。

G-MDSCs通过癌症期间异常分化的轨迹而出现

为了在脾脏中重现导致MDSC生成的成熟过程，并确定其相对于正常祖细胞和成熟中性粒细胞群的分化状态，研究者接着使用Monocle对scRNAseq数据集进行无监督的伪时态分析排序。研究者重点关注Ly6g⁺中性粒细胞子集（图1,B和C中的C0,C2,C4,C5,C7和C8簇），因为与M-MDSCs相比，研究者在这个分析中重新获得足够多数量的总中性粒细胞和G-MDSCs，以确保得到一个能够解释的结果。研究者首先生成了一个新的基于Seurat的中性粒细胞子集，接着使用这组新定义的标记基因来进行Monocle分析。结果导致具有五种不同细胞状态的三分支轨迹出现（图5A）。为了解释这种轨迹，研究者将该结果与近期使用scRNAseq进行的工作进行了比较，从而定义小鼠骨髓中初生造血干血胞、祖细胞和分化细胞状态的特征，这表明中性粒细胞的祖细胞具有Elane、Mpo和Prtn3等基因标记，而成熟的中性粒细胞表达Camp、Ltf和Lcn2的水平提高。研究者将这些标记与研究者工作中的MDSC标记（图1F）整合在一起，从而能够注释这五个状态。首先鉴定的是中性粒细胞的祖细胞（状态4；Elane-hi），其增殖增加，并形成了伪时态分析的开始。然后这些祖细胞在一个分支上分出成熟的中性粒细胞（状态3；Camp-hi），在在另一分支上分出MDSC（状态1；Cd84-hi），正如伪时态分析的基因图中所示（图5B），这表明G-MDSCs通过可选择的成熟过程从中性粒细胞的祖细胞内产生。

图5. G-MDSCs通过癌症期间异常分化的轨迹而出现。（A）对Ly6g⁺中性粒细胞簇的子集进行中性粒细胞-特异性的Monocle分析，产生具有五种不同Monocle状态的分支轨迹（每种状态用颜色表明），并基于各自的基因表达谱进行命名。（B）伪时态图阐述了在整个伪时态期间所选标记基因的表达，其中以状态1结束的分支用虚线表示，以状态3结束的分支用实线重点凸出。中性粒细胞的祖细胞的特征是高水平的Elane、Mpo和Prtn3（状态4），其在一个分支上分出成熟的中性粒细胞（状态3；Camp、Ltf和Lcn2），在另一个分支上分出MDSC（状态1；Cd84）。（C）早期的G-MDSC过渡以Asprv1、Plscr1和Pirb的高表达为标志。（D）概要示意图表明，G-MDSCs通过中性粒细胞分化的异常形式从中性粒细胞的祖细胞中出现，而不是由重编程为免疫抑制细胞的成熟中性粒细胞中出现。

Monocle在MDSC分支的开始附近检测到另外两种细胞状态（状态2和5）：状态5的特征是核糖体基因数目高，表明翻译活跃的细胞状态，状态2代表MDSC分化的最早阶段，其特征是Asprv1、Plscr1和Pirb（成对的免疫球蛋白样受体b）的高表达（图5C）。据报道，中性粒细胞通过Asprv1促进慢性炎症，表明Asprv1编码的天冬氨酸蛋白酶可能在功能上有助于脾脏中MDSCs的出现。此外，Pirb据报道调节MDSCs的抑制功能和命运，表明Pirb是生成MDSC所必需的。总之，这些发现说明G-MDSCs通过中性粒细胞分化的异常形式从中性粒细胞的祖细胞中出现，而不是由重编程为免疫抑制细胞的成熟中性粒细胞中出现（图5D）。此外，研究者的工作确定了早期的过渡性MDSC状态，其特征是许多基因仅在分支点附近和MDSC分化过程中表现出表达升高，而在正常祖细胞或成熟中性粒细胞的轨迹中则没有。这可能暗示着过渡性MDSC状态可以作为靶标从而阻止其分化为成熟的MDSCs，同时不影响正常中性粒细胞的成熟和功能。

研究还采用与上述中性粒细胞类似的方法进行了单核细胞-特异性子集的Monocle分析，产生了类似的三分支轨迹，表明在M-MDSC成熟过程中发生了一个类似的可替代成熟过程。与中性粒细胞-特异性轨迹分析结果相反，研究者的单核细胞-特异性分析中并没有出现过渡状态，这可能是因为单核细胞中的细胞数量较少和潜在过渡状态的覆盖率降低。

讨论

了解肿瘤微环境抑制活跃的抗肿瘤免疫反应的细胞学和分子学机制，对于改善目前的癌症免疫治疗方法（比如程序性死亡1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4等查核点抑制剂或嵌合抗原受体T细胞治疗）将十分重要。MDSCs代表一种微环境成分，在这种环境中它们通常在癌症患者中扩展，并促进各种不同癌症（包括乳腺癌在内）中的晚期肿瘤进展和T细胞抑制。本文中，研究者生成了癌症期间MDSC成熟的单细胞转录组图，以剖析患乳腺癌小鼠MDSCs的独特分子特征，并阐明这些免疫抑制细胞与其正常髓样对应物之间的区别。利用这一资源，研究者确定了MDSC-特异性基因标记，该基因标记在G-和M-MDSCs之间广泛共享，但与其正常髓样对应物有很大不同，同时通过分化的异常途径从中性粒细胞的祖细胞中重现了它们的分化轨迹，并鉴定了用于检测和未来MDSCs分离的MDSC-特异性的细胞表面标记。

用于乳腺癌的MMTV-PyMT小鼠模型是为研究乳腺癌而使用最广泛的模型系统之一，其与人类发病机理极为相似，并且已经知道其在肿瘤进展过程中会诱导MDSCs的显着发展。研究者在本文中表明脾脏是能够可靠检测到MDSCs的主要器官部位。为了鉴定与MDSC功能相关的独特分子特征，研究者使用scRNAseq作为一种强大且公平的方法来揭示在单细胞水平上来自WT对照小鼠和荷瘤PyMT小鼠脾脏中经FACS-分离的CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺细胞群体中隐藏的变异。该数据集不仅提供稳态条件下（WT小鼠）脾脏中单核细胞/中性粒细胞异质性的单细胞水平描述，而且阐明了MDSCs如何在单核细胞和中性粒细胞类似的细胞中以独特簇的形式出现，这使研究者能够确定MDSC-特异性基因标记。G-和M-MDSCs之间存在明显的重叠，表明单核细胞和中性粒细胞均具有相似的免疫抑制特征。MDSC标记包括与免疫调节相关的各种基因，比如Arg2和Cd84，以及趋化因子受体（如Ccr2和Cxcr2），这表明MDSC响应于中性粒细胞/ MDSC-招募的趋化因子，并指导其迁移至炎症的活性部位（如原发性肿瘤或癌症转移灶）（图6）。

图6. 癌症期间脾脏内中性粒细胞异常分化的建议模型。利用常见的骨髓祖细胞，骨髓细胞在骨髓中与造血干细胞区分开来。常见的粒细胞/单核细胞祖细胞在骨髓中扩增并转移到脾脏中形成边缘池，在那里它们引发正常的中性粒细胞成熟，而在癌症期间通过异常的中性粒细胞分化形成G-MDSCs。研究者的发现表明，MDSC-特异性基因标记在G-和M-MDSCs之间基本共享，但不同于它们正常的髓样对应物。这种MDSC标记包括许多趋化因子受体，可能引导它们向原发性肿瘤或转移部位迁移（如箭头所示），在那里它们可能庇佑肿瘤细胞免受抗肿瘤免疫的影响。G-CSF：粒细胞集落刺激因子。

研究者的发现表明，G-MDSCs可能通过异常的分化轨迹从中性粒细胞的祖细胞中出现，从而出现正常条件下不存在的细胞状态。使用伪时态分析排序调查研究者观察到的细胞状态，并将其与在单细胞分辨率条件下定义各种造血干细胞和祖细胞状态特征的最新研究进行了比较，这使研究者能够从中性粒细胞的祖细胞中重现MDSC形成的异常轨迹，这是以牺牲正常分化为成熟中性粒白血球（在荷瘤小鼠中较少）为代价的（图5A）。进一步调查分支到G-MDSCs的初始过渡细胞状态后，研究者发现了几个在该过渡期中表达显着增加的基因（图5C），这似乎表明对这些基因产物进行治疗性干预可能会在MDSC功能活跃前阻止其分化。

尽管本文为MDSC生物学提供了一些新见解，但本研究的分析仍存在一些潜在的局限性。一个局限性就是无法清楚地区分scRNAseq数据中的单核细胞和巨噬细胞。因此，可以想象的是本研究中流式细胞术的方法包括来自脾脏的巨噬细胞，但是，其在研究者的计算分析中并没有以明显的簇出现。因此，研究者无法澄清有关M-MDSCs作为巨噬细胞或单核细胞性质这方面的讨论。其次，尽管研究者的发现表明脾脏可能在MDSCs形成和成熟过程中发挥了关键作用，但脾脏重要性的问题也应在未来的研究中进行解决，例如在患癌小鼠模型中进行脾切除实验。最后，本研究仅依赖于单一癌症，即乳腺癌。本文报道的发现是否适用于其他癌症背景还有待确定。

对于研究MDSC的研究人员来说，主要问题是用于检测和前瞻性分离等功能性调查的MDSC-特异性细胞表面受体相对缺乏。在这里，研究者确定了MDSCs上的CD84和JAML等细胞表面受体，可将其与CD11b/Gr1染色结合使用从而检测荷瘤小鼠各种器官中MDSCs的存在或与CD11b/CD14或CD15结合使用检测人体内MDSCs的存在。CD84参与细胞间的相互作用，调控多种免疫细胞的激活和分化，并作为B细胞和单核细胞上的同嗜性粘着分子起作用，同时在T细胞中其在较低程度上增强了干扰素-γ的分泌和激活。CD84可以调节慢性淋巴细胞白血病中PD-1/程序性死亡配体1的表达和功能，从而抑制T细胞的响应和活性，这表明CD84可以使MDSC直接调节乳腺癌患者的免疫查核点。

乳腺癌是最普遍的癌症类型之一。在乳腺癌发生期间，乳腺癌细胞分泌各种细胞因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），它们对造血作用和骨髓细胞分化产生了系统性的作用，从而促进骨髓衍生抑制细胞（MDSCs）的发展。但MDSCs的独特分子特征目前尚不清楚，其是否代表了一个与正常、健康的髓样对应物不同的亚群，这也不清楚，从而极大地限制了人们确定特定MDSC功能的能力。本文中，研究者使用单细胞RNA测序（scRNAseq）描述了乳腺癌MMTV-PyMT小鼠模型中MDSCs的分子特征。通过对scRNAseq数据的计算分析，研究者揭示了独特的MDSCs基因标记（如CD84和JAML），且这些标记在G-和M-MDSCs之间基本共享，但与正常髓样对应物相比有很大差异。本研究加深了人们对MDSC生物学的理解，促进了癌症相关MDSCs的研究，为乳腺癌的治疗提供了新的治疗途径。