【述评】CADASIL的遗传学研究探索与挑战

文章来源：中华神经科杂志, 2021,54(11) : 1103-1108

作者：王凤羽 张杰文

摘要

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）是成年人中最常见的单基因遗传性脑小血管病。随着基因测序技术以及影像学的发展，该疾病越来越被人们所认知。文中根据最近几年的研究进展，从遗传学角度简述了CADASIL患者中NOTCH3基因突变的类型、不同人群突变热点区域与位点以及基因型与表型之间的关联，并对未来该疾病的基因治疗进行了展望。

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是一种非动脉粥样硬化、非淀粉样变性的脑小血管病，也是成年人中最常见的单基因遗传性脑小血管病。典型的临床症状为偏头痛、反复脑卒中发作、认知功能减退和情绪障碍，通常中年起病。1993年Tournier等^［1］用连锁分析的方法将此病的致病基因定位于19号染色体上，并首次统一命名为CADASIL。1996年发现该病的致病基因是notch受体3（notch receptor 3，NOTCH3）基因^［2］。根据人们对于疾病的认知，CADASIL疾病研究的发展可分为3个阶段：1976—1996年，从临床案例到NOTCH3致病基因的鉴定；1996—2016年，从NOTCH3致病基因鉴定到临床和临床前研究；2016年至今，从转化研究到基因治疗时代^［3］。

NOTCH3是4种哺乳动物NOTCH同系物之一，含有33个外显子，编码1种由2 321个氨基酸组成的兼有受体和信号转导功能的单通道跨膜蛋白，主要表达于血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）以及周细胞，在VSMC的成熟和分化中起着重要的作用。NOTCH3蛋白由胞外域（extracellular domain）、跨膜结构域（transmembrane domain）和胞内域（intracellular domain）组成。胞外域包含34个表皮生长因子重复序列（epidermal growth factor-like repeat，EGFR），是受体与配体结合的关键部位，每个EGFR含有6个高度保守的半胱氨酸残基，可两两结合形成3个二硫键，从而维持蛋白的稳定性^［4］。典型的CADASIL患者中NOTCH3基因EGFR中氨基酸发生突变，导致半胱氨酸奇数改变（通常为5或7）。这使得原本稳定的二硫键模式被打破，蛋白质构象发生改变，影响NOTCH3受体蛋白与配体之间的相互作用，也会导致异常的蛋白质多聚化增加，VSMC成熟和分化异常，引起一系列病理及临床表现，并最终使脑血流量减少、造成脑卒中和血管性痴呆^［5］。NOTCH3胞外域被认为是CADASIL的特征性病理变化嗜锇性颗粒物质（granular osmiophilic material，GOM）的主要构成成分。在电子显微镜下可观察到GOM在血管平滑肌细胞表面沉积，不仅累及发病脑组织，还可累及骨骼肌、心肌、周围神经、肝脏、肾脏、小肠和皮肤等，因此临床上可利用皮肤活组织检查（活检）检测GOM沉积^［6］。

CADASIL在世界不同地区、不同人群中均有病例报道，但具体的患病率不甚清楚。全球范围内的患病率大约为（2~5）/10万，比如英格兰东北部与苏格兰西部分别是1.3/10万和1.9/10万，意大利是4.1/10万^［7］，而我国还没有系统的流行病学资料，该病已被列入2018年国家颁布的第一批罕见病名录。随着研究的深入，逐渐发现患病率可能被低估。据报道在ExAC全外显子组数据库上查找了NOTCH3基因206个在EGFR结构域中的可导致CADASIL疾病的半胱氨酸数量失衡突变。突变携带频率为3.4/1 000，比基于CADASIL疾病测算的患病率预估值要高出100倍^［8］。这挑战了当前的疾病模式，强烈提示了临床对于CADASIL疾病认知的有限性，某些突变类型可能更倾向于温和的表型，使得临床上没有被识别出来。

CADASIL从致病基因被发现，经历了20多年的发展，逐渐被人们所认知，不过仍有很多问题悬而未决。下面仅从遗传学角度提出目前所进行的探索以及所面临的挑战。

一、了解NOTCH3基因突变类型与热点，判断突变的致病性

在HGMD（The Human Gene Mutation Database）专业版数据库中目前CADASIL患者NOTCH3基因突变超过300种。绝大多数以错义突变为主（约95%），也有剪接突变、小的插入删除、无义突变等类型。绝大多数突变（约98%）位于编码34个EGFR的NOTCH3胞外域的2~23号外显子内，并且涉及典型的与CADASIL相关的半胱氨酸残基改变^［5］。

国内外研究发现CADASIL患者中NOTCH3基因的突变主要集中在第3、4、5、6、8、11、18外显子。然而不同人群NOTCH3基因突变热点外显子区域是存在差异的。其中白种人中NOTCH3基因第4外显子突变率最高，其次位于第3和第11外显子，而在亚洲国家和地区，比如日本的研究结果显示突变最常见的区域是4号外显子，其次是3、6、8号外显子^［9］。至于我国CADASIL患者NOTCH3基因突变情况，文周等^［10］报道2009—2016年中国金域检测中心检测出275例NOTCH3基因突变阳性CADASIL患者，最常见的突变区域是第4以及11号外显子。局部地区比如我国北部以3、4号外显子多见，东部地区则为4、11号外显子^［11］。Chen等^［12］通过分析我国大陆东南部情况结果也显示第11号外显子突变最为常见（41.07%），其次为第4以及第3号外显子，分别占33.33%和13.69%。我国台湾地区则与大陆东南部的研究结果相似，也是第11号外显子为最常见的突变区域，其次是第4号外显子^［13］。我们实验室2017年总结了河南地区19个家系37例患者资料发现NOTCH3基因突变的热点集中在11以及4号外显子^［14］。

另外，NOTCH3基因突变热点位点也具有明显的地区和族群差异。比如：意大利中南部地区最常见的突变是第11号外显子的R607C（21%），芬兰为第3号外显子的R133C（87.5%）^{［15, 16］}。东亚地区较为相似，韩国济州岛^［17］最常见的突变是第11号外显子的R544C，而我国台湾地区R544C位点占比高达70.5%^［13］。文周等^［10］的研究结果显示R544C位点也是我国大陆地区最为常见的位点，达到23.27%。Chen等^［12］的研究主要集中在我国大陆东南部，最主要的突变位点是第11号外显子的R607C（19.05%）、R544C（15.48%）以及第3号外显子的Arg90Cys（8.93%），其中R607C主要集中在江苏、上海和浙江，而R544C集中在福建与台湾。东亚地区比较特别的是日本，最为常见的突变位点是R133C（23%）、R75P（13%）以及R182C（13%）^［9］。

虽然CADASIL患者中NOTCH3基因突变主要是导致半胱氨酸数量改变的突变（文中简称半胱氨酸突变），然而随着测序的普遍，也有不少考虑为CADASIL的患者检测出NOTCH3基因不涉及半胱氨酸的改变（文中简称非半胱氨酸突变）。目前，这些突变的致病性是存在争议的，有的学者认为属于基因多态性，而非致病性突变。这种情况在欧美发生概率极低，在日本、韩国等人群中较多，中国也有案例报道，其临床意义仍有待进一步探索。据此Muiño等^［18］提出了1个标准可以参考，即若符合以下5点，则该突变有致病意义：（1）CADASIL典型的临床表现；（2）MRI显示弥漫性脑白质损伤；（3）NOTCH3基因全外显子检测且排除了半胱氨酸突变；（4）突变为非多态性；（5）活检发现嗜锇颗粒沉积。根据这个标准，我们实验室^［19］报道了5例CADASIL患者携带非半胱氨酸突变，分别为R75Q、D80G、V237M、S1418L以及R1761L。同时分析了非半胱氨酸突变患者的临床和影像学特征，与经典型CADASIL相比非常相似并无明显区别。虽然总结的病例较少，但这是国内系统分析非半胱氨酸突变潜在致病性以及临床特征的首次报道，大大提高了对疾病的认知程度，也为我们探寻CADASIL的致病机制提供了新的线索。

随着人类基因组计划的完成，测序技术不断迭代，测序成本呈超摩尔定律的急剧下降，使得人类积累的基因变异数据越来越多。如何解读这些海量的数据是后基因组时代的挑战，对于NOTCH3基因也不例外。目前绝大多数还是在病例中发现变异，可以根据美国医学遗传学和基因组学会（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分级标准判断基因变异是否具有致病性，有条件的还可以进一步进行细胞功能以及动物模型研究。ACMG撰写了英文版的分级标准^［20］，我国贺林院士牵头组织专家也进行了中文版的编写^［21］。遗传变异可分为致病的、可能致病的、良性的、可能良性的、意义不明的5个等级。在这个基础之上，具体到疑似CADASIL患者NOTCH3基因变异的判断，一般说来EGFR区域内的涉及半胱氨酸的突变致病性争议不大，而那些非半胱氨酸突变，或是非EGFR区域内的突变，一定要结合临床、影像、病理等方面信息，特别是皮肤活检GOM沉积或是NOTCH3胞外域免疫组化，做到具体问题具体分析。

二、总结不同基因型临床及影像特征，揭示基因型与表型之间关联

遗传学一直致力于探寻基因型与表型之间的关系，希望根据不同基因型对疾病表型进行一些预测与判断，从而辅助临床诊断或是判断预后。携带NOTCH3基因EGFR重复区域内涉及半胱氨酸突变的患者通常表现出比较典型的CADASIL症状，比如最常见的临床症状为偏头痛（尤其是白种人，亚洲人少见）、反复脑卒中发作、认知障碍、情感障碍。影像学以白质高信号（尤其是颞极和外囊）、腔隙性梗死为主，伴或不伴微出血及血管周围间隙。

由于奠基者效应的存在，在某些地区某一种特定突变型患者比较多，学者们就有可能对其进行详细系统的研究。比如研究比较多的R544C突变。Lee等^［17］研究了韩国济州岛73例携带NOTCH3基因R544C突变的CADASIL患者，发现受试者的平均年龄为62.2岁（34~86岁）。脑梗死是最常见的表现（37%），其次是认知障碍（32%）、头痛（17%）、精神症状（16%）、脑出血（12%）、短暂性脑缺血发作（7%）和癫痫发作（1%）。并且与典型的CADASIL相比，发病年龄较晚，缺血性或出血性发作患者的年龄为（64.9±10.9）岁（范围41~86岁）。我国台湾地区CADASIL患者中NOTCH3基因R544C突变与前颞叶受累频率较低、发病年龄较晚和认知功能障碍频率较高有关^［13］。在另一项我国台湾地区的研究^［22］中，发现NOTCH3基因R544C也是小血管梗塞性（small vessel occlusion，SVO）脑卒中重要的风险因素。在调整血管危险因素后，携带p.R544C变异体导致脑卒中的风险增加了3.40倍，SVO脑卒中的风险增加了11.05倍（P值分别是0.000 1和3.9×10^-10）。

至于非半胱氨酸突变的表型，也有学者进行了探索。Xiromerisiou等^［23］对发表的NOTCH3基因突变进行了广泛的文献研究，并对所有已发表的NOTCH3突变病例进行了系统的回顾。他们发现半胱氨酸和非半胱氨酸突变患者的临床表现和表型严重程度没有显著差异。然而，半胱氨酸与非半胱氨酸突变患者相比，发病年龄显著更早（平均差异7.8岁，95%CI 2.2~13.5，P=0.009），分别为43岁和51岁。韩国的一项研究结果显示：两者临床特征与体征差异无显著性，非半胱氨酸突变患者在前颞叶脑白质改变的频率低于半胱氨酸突变患者，而其他部位脑白质以及脑微出血的频率和程度两者之间是相似的，也就是说经典型的半胱氨酸突变脑白质改变更易出现在前颞叶^［24］。

除了突变类型以外，突变的位置也会影响表型。不同外显子区域患者发病年龄存在差异，Chen等^［12］发现携带第11号外显子突变的患者发病年龄一般在50岁左右，较其他外显子突变患者晚。至于CADASIL首发临床症状与NOTCH3基因不同外显子突变之间的关联，翟宇和苏敬敬^［11］的研究结果提示NOTCH3基因第4号外显子突变的患者以运动、语言障碍起病占多数，而第19号、20号外显子突变的患者以认知障碍起病更多见。Rutten等^［25］研究结果显示NOTCH3突变位点位于EGFR 1~6区域的比突变位点在7~34区域的患者具有更加严重的临床表型，脑卒中发病年龄更早，预期生存期更短，脑白质损伤负担也更严重。目前已有很多软件可以帮助判断基因变异是否有害。Xiromerisiou等^［23］根据CADD（combined annotation-dependent depletion）算法，对NOTCH3基因不同单核苷酸以及插入删除变异的危害进行致病性评分，发现致病性评分似乎完全受不同外显子位置的影响（P<0.001），与表型严重程度无关。

我们知道CADASIL是常染色体显性遗传病，即NOTCH3基因杂合突变即可致病，不过在实践中也有少数CADASIL患者NOTCH3纯合或复合杂合突变被报道。在其中一些患者中，表型被发现更严重，而另一些患者报告的临床严重程度类似于杂合突变携带者。Al-Shaar等^［26］报道了1个受累3代的携带R1231C突变的CADASIL家系，13例患者中7例为纯合子，6例为杂合子，纯合子个体与杂合子个体相比，早期发病的临床和影像表型略显严重。而He等^［27］报道的1个兄弟二人均携带R587C纯合子的CADASIL家系中，他们表现为缺血性脑卒中、步态不稳、认知障碍和精神障碍等，与先前报道的杂合子相同突变的患者相似。总的来说，迄今为止所描述的纯合突变患者具有正常的CADASIL疾病谱中的表型，严重程度的变化不明显，可能归因于CADASIL中所见的自然异质性。

虽然有学者认为一些突变可能与更温和或更严重的表型有关，但到目前为止还没有发现明确的基因型-表型相关性。总的来说，携带EGFR区域内涉及半胱氨酸数目改变的突变以及位置越靠EGFR前段的突变，CADASIL患者症状越典型、临床症状越严重。NOTCH3基因突变纯合子个体临床表型并不一定比杂合子个体更严重。由于疾病的严重程度可能在家庭成员之间，甚至在单卵双胞胎之间有所不同，因此，除NOTCH3基因突变外，其他因素很可能在疾病中发挥表型修饰作用，比如个体的遗传背景、血管危险因素、生活方式等多种内外因素。遗传因素方面，载脂蛋白E（ApoE）基因是研究最多的风险基因，不过结果不尽相同。Gesierich等^［28］发现ApoE ε2型与CADASIL患者的脑白质高信号（white matter hyperintensities，WMH）的体积有关，Lee等^［29］发现ApoE ε4型提高了韩国CADASIL患者痴呆的风险，而Singhal等^［30］的研究结果则显示ApoE ε4型对于患者的表型是没有影响的。另外，Opherk等^［31］结合从欧洲7个中心收集的517例CADASIL患者的Affymetrix芯片数据进行了全基因组关联研究，以确定影响CADASIL患者WMH体积的数量性状基因位点。结果发现多基因评分与CADASIL受试者的WMH体积有关，多个微小效应的遗传变异影响WMH负担，不过并没有单个核苷酸多态性达到全基因组范围的显著性差异。在其他非遗传因素方面，有研究^［7，30］结果表明高血压、吸烟会增加CADASIL患者发生脑卒中的风险，而高同型半胱氨酸水平与偏头痛的风险增加有关。另一篇文献^［32］报道家族中CADASIL患者与健康家系成员之间携带的所有血管风险因素的频率是相似的。在患者中，糖尿病与脑卒中发生年龄较早相关。因此对于没有有效治疗手段的CADASI，控制血管危险因素还是十分必要的。总之，疾病是遗传与环境互相作用的结果。即使对于单基因遗传病，除致病基因本身的突变形式与位置影响疾病的表型以外，其他方面的因素也会微效地修饰表型。

三、尝试CADASIL基因治疗，破局罕见病研究

CADASIL作为一种单基因遗传病，目前没有有效的治疗手段。由于该病特征性的病理改变是NOTCH3胞外域异常沉积，因此有学者在CADASIL模型鼠上探索NOTCH3胞外域单克隆抗体5E1的治疗潜力。结果显示长期使用5E1不能减弱NOTCH3胞外域或GOM的沉积，也未能停止白质损害的发展，但对神经活动和局部应用血管扩张剂引起的受损脑血流反应以及脑动脉正常的肌源性反应有明显的保护作用^［33］。另一方面，基因治疗也是这一类单基因遗传病治疗的一个重要研究方向，有学者也开始了这方面的尝试。2016年Rutten等^［34］通过设计针对包含致病性CADASIL突变热点区域的外显子4、5设计反义寡核苷酸，转染CADASIL患者来源的脑血管平滑肌细胞，成功地实现了外显子跳跃而不会影响NOTCH3信号传导。外显子4和5包含EGFR2的部分，EGFR3、4、5全部，以及部分EGFR6，经过反义寡核苷酸介导，实现EGFR3/4/5的跳跃，使得2与6融合到一起。氨基酸第153位额外增加的无法配对的半胱氨酸可以与EGFR6中的半胱氨酸配对，从而形成稳定结构。2020年该团队另一项研究^［35］发现在人体内存在自然发生的可导致NOTCH3基因外显子跳跃的特殊现象。报道的CADASIL患者携带半胱氨酸突变（G498C），虽然理论上携带EGFR区域内半胱氨酸突变的患者表型应该比较典型，但家系成员症状温和，只有WMH，而且60岁以上的患者也没有出现认知损害。研究发现突变位于第9号外显子的边界，影响了RNA的剪接从而造成整个第9号外显子的缺失。这也侧面印证了CADASIL患者“半胱氨酸纠正”可能降低NOTCH3蛋白聚集从而减轻症状，为治疗提供潜在的可行性。

虽然这些研究只是CADASIL基因治疗方面初步的尝试，但意义重大深远，为这种罕见病的治疗开启了新的研究方向，希望在不久的未来会有突破性的进展。

参考文献略