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在过去几年中，肠脑轴相关的研究大幅度加速。许多综述概述了肠道微生物群与人类大脑功能和行为之间关系的重要意义。整合肠道微生物组和大脑数据的一个重大缺陷是缺乏能够同时捕获两种模式差异的综合多变量方法。为了解决这个问题，本文对微生物群和大脑连接数据应用了链接独立成分分析（LICA）。 本文分析了来自58名健康女性（平均年龄21.5岁）的数据。使用静息状态功能成像数据作为磁共振成像数据。粪便肠道微生物组成的评估基于16S rRNA V4基因区域的测序。使用LICA分析将受试者的大脑网络和微生物组相对丰度数据同时分解为空间和丰度变化的10个独立成分。 LICA分解产生了四个对微生物数据具有非边际贡献的成分。默认模式网络在三个成分中具有很强的特征，而双侧额顶叶注意网络则包含一个成分。执行控制（默认模式）网络与另一个成分相关。Prevotella属的微生物丰度与所有脑网络的表达强度相关，而双歧杆菌与默认模式网络和额顶叶注意网络相关。 考虑到两个系统的复杂性，我们为健康人类肠道微生物群和大脑网络连接之间的多变量关联模式提供了首次探索性证据。本文发表在Gut Microbes杂志。 关键词：关联ICA，肠道微生物群，大脑连接网络，fMRI，静息状态，双歧杆菌，Prevotella 肠脑轴（GBA）是发生在胃肠道（GI）和中枢神经系统（CNS）之间的双向生化信号。微生物群-GBA用于描述共生肠道细菌（微生物群）在肠道和大脑之间相互作用中的复杂影响。最近，许多研究概述了理解肠道微生物群与人类大脑功能和行为关系的重要意义。已经提出了几种中介途径，具体而言，微生物群和大脑之间的双向相互作用可能通过迷走神经活动的调节，通过神经调节剂或其前体，如血清素或色氨酸，通过下丘脑-垂体-肾上腺系统（HPA轴）和与免疫系统的相互作用。 近年来，研究人员旨在阐明这些相互作用中的途径，激素或免疫因子并靶向某些细菌菌株的活性和相互作用。然而，这些研究没有考虑到大脑和肠道微生物组的复杂性，特别是完整的多变量性质。 这些复杂特征之一是不同脑区之间的内在连接。到目前为止，评估肠道微生物组组成与大脑内在连接（静息状态fMRI功能连接）之间关系的研究是罕见的，严谨性有限，并且没有定论。最近的一项研究测试了使用四周多菌株益生菌补充剂的效果。作者报告了温和的益生菌诱导的10个功能网络中一些静息状态的连接变化。在安慰剂组（n=15）和益生菌组（n=15）之间的差异中发现了最强的调节作用，后者显示出突显网络与上额叶区域的连接性显著提高。在另一项益生菌相关的安慰剂对照试验（每组n=20）中，长双歧杆菌影响了用脑磁图（MEG）测量的静息神经振荡，这与社会压力诱导的任务期间的活力增强和精神疲劳的减少相关。益生菌对θ和α波段的调节局限于额叶和扣带回和边缘上回。然而，这些结果（在相对较小的样品中）与益生菌诱导的对肠道微生物群组成的影响无关。 一些研究确实评估了肠道微生物组成与大脑内在连接之间的关系。一项静息态fMRI研究（n=30），其中包括吸烟者的亚组，重点关注肠道微生物群组成与岛叶连接的关联，并发现它与几个脑区（如枕回和舌回，额叶和小脑区域）的功能连接与微生物群多样性和分布有关。其他感兴趣脑区（ROI）分析没有发现显著的相关。另一项静息状态fMRI研究（n= 28 vs 19）的结果表明，在终末期肾病中，默认模式网络（DMN）的完整性随着肠道-微生物群组成的改变而降低。最近的一项研究（n = 157）侧重于研究肠道中的某些肠型和微生物多样性指标及其与特定大脑网络的关联。作者发现肠道微生物多样性测量与执行控制网络，默认模式网络和感觉运动控制网络的连接以及执行控制网络内部有显著相关。最近的另一项研究调查了与精神分裂症组比，皮质厚度，区域一致性（ReHo）和低频波段振幅（fALFF）与相对丰度的关系。该研究中使用的“功能性”指标（ReHo和fALFF）应谨慎解释，因为它们的值可能受到非神经元来源的影响。他们发现Ruminococcus和Roseburia两个属的微生物相对丰度，以及大脑的相关指标存在差异，这些差异可能与精神分裂症的神经病理学有关。 最重要的是，以前对健康个体的研究只在一个肠道微生物组组成和一个大脑连接网络（即在一个网络内或两个大脑网络之间）之间进行了双变量关联分析（尽管是多重比较或部分效应控制）。总而言之，这些结果很难整合和理解，因为研究集中在一个方面，例如来自一个特定ROI或不同类型的干预措施的功能连接。此外，在目标患者群体中研究肠脑轴具有很大的价值，特别是对于肠道微生物群在特定疾病背景下的相关性，但只要在宏观层面上没有充分理解肠脑轴的健康功能，评估某些病理的后果就很困难。我们在这里主张是用健康成年个体的多变量联合分析作为出发点。 在研究中，理解复杂系统的一种方法是尝试按顺序阐明其所有成分的功能，然后整合有限数量的成分之间的相互作用。另一种方法是以宏观层面的整合为目标，通过降维来研究。在多篇综述中经常以叙述方式进行肠脑轴的分析。然而，到目前为止，还没有在宏观水平上尝试整合大脑和肠道微生物组的功能，以确定两个系统的宏观成分之间的相关性。在类似的方法中，使用来自人脑连接组的数据，研究人员将几种生活方式、人口统计学和心理测量方法与大脑连接的正负模式联系起来。 作者的目标是评估这两种复杂的多变量模式之间的关系，重点关注处于静息状态的大脑网络在健康的个体中运行的主要模式。作者探索肠道微生物组属丰度的个体间差异是否与脑网络中大脑功能连接的差异有关，同时考虑到两者的复杂性。这样做是希望： （1）验证过去的研究，而这些研究已经证明了大脑连接和肠道微生物群之间的关联，无论是通过益生菌干预还是通过关注选定的脑网络/脑区和细菌菌株； （2）提供一个有针对性的探索性“地图”，说明相关的肠道微生物群和大脑连接之间还没有被探索的潜在候选连接； （3）为研究大脑功能连接-肠道微生物群相关性以及研究复杂干预诱导的肠脑轴变化的方法提供类似的指导。 一个重大的方法学挑战是将肠道微生物组和大脑数据的多变量同时整合，从而能够同时捕获两种模式的差异。为了解决这个问题，作者应用了链接独立成分分析（LICA）处理微生物群和大脑连接数据（图1）。LICA能够同时在几种模态中数据降维，从而可以验证不同模态中个体间变异模式。作者选择了四个特征良好且重复性高的大脑网络进行研究。在之前的工作中，作者研究了禁食对静息态功能连接的影响。由于在神经影像学领域的重要性，以及相对清晰的认知功能特征以及在精神疾病或之前的微生物研究中的重要性，作者将研究限制在一组四个感兴趣的网络：（侧向额顶叶（左/右）注意网络FPN，执行控制网络ECN和默认模式网络DMN）。这样能够更好地理解肠道与这些大脑网络之间的关联机制，从而限制了相互作用的数量而不限制互动的类型。
图1 将四种大脑网络中的功能连接与人类肠道细菌（微生物群）的相对丰度联系起来。图A描述了同时分解四个网络的功能连接差异和细菌分类群（属）的相对丰度的链接ICA。这产生了10个成分，其中有单独的成分和图B中描述的每个输入特征的负载。负载表示每个网络的功能连接中与成分的体素关系，以及与肠道微生物组中不同属的相关。 本文分析了益生菌干预研究对64名健康女性参与者（平均年龄= 21.5±0.45岁）的干预前数据。64名被试中有58名被纳入分析。由于高抑郁评分（N = 1），粪便样本缺失（N = 2）以及采集时头动超过4毫米（n = 3），六名参与者被排除在最终分析之外。有关样品和排除标准以及道德声明的更详细内容，请参阅材料和方法部分。简而言之，具有神经和/或胃肠道疾病等相关病史的被试被排除在外。此外，抗生素使用和纯素饮食，也是排除标准的一部分。 对被试进行磁共振成像（MRI）的检查。MRI数据是使用3T MAGNETOM Prisma系统采集的，该系统配备了32通道头线圈。在三次短时间的任务态相关fMRI扫描后，获得9分钟的静息状态fMRI图像。使用T2加权梯度回波多回波序列获得3D回波平面成像（EPI）扫描（体素大小3.5×3.5×3 mm各向同性，TR = 2070 ms，TE = 9 ms; 19.25 ms; 29.5 ms;39.75 ms，FoV = 224 mm）。受试者被要求睁着眼睛静静地躺着，不要有定向思考。使用MPRAGE序列（体素大小1.0×1.0×1.0各向同性，TR = 2300 ms，TE = 3.03 ms，192层）获得全脑高分辨率T1加权结构像扫描。 MRI数据预处理：FSL用于预处理、数据去噪和生成特定的脑网络图。预处理步骤包括三维头动校正，以及使用5 mm半全宽最大值（FWHM）高斯核进行空间平滑，以减少受试者之间的变异性，以及高通滤波器（>0.007 Hz）。除时间滤波外，所有预处理步骤都是在 AROMA 数据去噪之前进行的。简而言之，ICA-AROMA旨在通过将单个主体ICA成分与四个强大的标准化功能相匹配来识别与头动相关的伪影。通过ICA的线性回归进行去噪，由AROMA识别为噪声，然后进行高通滤波。在所有组分析之前，数据使用FMRIB的非线性图像配准工具（FNIRT）被配准到MNI空间，并进行重切至2 mm3分辨率。 双重（空间和时间）回归用于生成经过充分研究的大规模脑网络的特定空间分布图。这些大型脑网络由10个静息状态网络组成，模板可以免费下载。本文下载了10个匹配良好的静息状态网络作为本研究的模板。这些网络的z-maps在一个4D影像文件中进行时间功能连接，并用作回归的输入。这些图谱用于针对单个fMRI数据的线性拟合模型，从而产生特定被试的时间动力学。随后，这些时间过程矩阵被用于针对被试fMRI数据的拟合线性模型中，以估计被试特定脑网络的空间分布图。从这10个脑网络中，作者选择了四个感兴趣的网络（左和右侧额顶注意网络FPN；执行控制网络ECN和默认模式网络DMN），由于它们在神经影像学领域的重要性，它们相对清晰的功能特征以及它们在精神疾病或以前的微生物组研究中的重要性。所有被试的不同空间分布图将合并到对应目标脑网络的单个4D文件中。通过这种方式，我们为四个脑网络生成了四个文件，这些网络为每个主题包含一个空间分布图，该图展示了每个体素与相应脑网络的相关性强度。这四个网络文件被用作LICA分析的输入。 在MRI扫描后24小时内使用OMNIgene·GUT试剂盒收集粪便样本。将收集的粪便样品运输到实验室并等分到1.5 mL Eppendorf管中，并储存在-80°C下进行微生物组分析。如前所述，使用Maxwell® 16仪器从粪便颗粒中分离出DNA。简而言之，在2步PCR方案中，通过使用515-F（GTGYCAGCMGCCGCTAA）和806-R（GGACTACNVGGGTWTCTAAT）引物靶向16S rRNA基因V4区域，并使用特异的编码来识别每个样品。测序由GATC Biotech AG（德国康斯坦茨）在Illumina HiSeq PE300平台上进行。序列使用NG-Tax处理的分析流程。NG-Tax使用三个核心元素确定了基于16S序列的样品分类：（i）样品条码引物过滤，（ii）操作分类单元（OTU）选择，其中相对丰度高于0.1%的独特序列根据序列相似性≥98.5%富集到OTU，以及（iii）使用SILVA数据库进行分类分配。这产生了一个包含844个OTU的表。作者在属水平上应用了普遍率过滤，筛选出至少30%的样本中存在的属。完成此步骤后，使用包含644个OTU的OTU表进行下游分析。门和属分类学水平的肠道微生物组组成表由R的“phyloseq”包提供。总之，微生物组成表是归一化后的结果，其中计数转换为微生物的相对丰度。 作者使用了LICA模型将脑网络图谱（ECN，FPN和DMN）和58名受试者的微生物组数据同时分解为独立的成分。在脑网络中，解释了空间分布变异；而在微生物组数据中，解释了细菌属相对丰度的变化。简而言之，LICA方法是贝叶斯ICA的扩展。使用多个输入数据集，其中所有单独的ICA成分分解都通过公共混合矩阵进行连接，该矩阵反映了对每个成分的贡献（图1）。 具体的操作见图1所示。成分分解提供了一组空间图谱（每个特征模态和一个组分），一个反映组分包含不同模态程度的特征向量，以及一个反映被试个体对给定组分贡献的特征向量。LICA成分分解中涉及的所有数学推导都可以在描述算法的原始论文中找到。实现每个特征提取过程以及LICA方法的更多详细信息和代码可公开获得。鉴于样本量作者采用了10个组分，分别忽略了微生物组或大脑网络边际贡献（比例<0.2）的成分。
对于58个受试者，左右顶额叶回注意网络（FPN），执行控制网络（ECN），默认模式网络（DMN）的空间模板被配准到受试者的静息状态fMRI时间序列上，为每个受试者创建网络图。ECN主要由额叶中回和额叶上回，扣带回皮层和背后顶叶皮层组成。ECN已被证明是在认知控制任务，情绪任务和反应抑制中观察到的大脑活动脑区。DMN是首次被识别出来的大规模脑网络，它可能是所有静息态脑网络中最常被研究的。DMN调节与多种疾病有关。DMN最突出的特点是其任务负相关性，当从事大多数任务时，它的脑区激活将被抑制。DMN与广泛的认知过程有关，例如自我思考和自我监控，被动的广泛关注，自动传记记忆检索，根据先前的经验赋予当前感官输入意义，走神和未来思考，以及稳态功能。正如这些网络的名称，额顶叶注意控制网络包括额顶叶大脑区域，这些区域通常与注意力任务中的大脑活动相关并随着不同程度的注意需求而调节。 肠道微生物组组成基于Illumina HiSeq平台上16S rRNA的V4区域测序。使用LICA模型将被试的大脑网络和肠道微生物组的相对丰度同时分解为10个独立成分。 10个成分中有6个成分对肠道微生物群相对丰度和大脑连接模式（成分0，1，3，4，6和7）表现出非边际贡献（比例>0.2）（图2）。这六个成分中，第一个提取的成分（组分0）由单个被试影响，因此，进一步分析忽略了这一成分。此外，对大脑连通性的健全性检查表明，对于成分4，所有体素的值相等。这使得该成分的解释几乎不可能，并且可能与残余噪声有关。因此，这一成分也被去除。
图2 大脑连接和微生物组的成分图。该图显示了每种输入模式所占成分的贡献百分比。FPr和FPl是左右额顶叶网络，DMN是默认模式，ECN是执行控制网络。 随后，作者研究了大脑连接与其余四种成分中肠道微生物群相对丰度之间的关系。通过不同模式的贡献（大脑或微生物组的比例>0.2）来表征每种成分。对于每个成分，作者绘制了大脑网络及其体素权重，并列出了与该成分无关的细菌属。对于大脑连接数据，以LICA的z值>3作为阈值进行展示（参见Neurovault：https:///collections/TRVFBPAB/）。z分数反映了体素协变与相应网络的相关性。对于微生物组数据，权重高反映了该成分中特定微生物属相对丰度的稳健协变量。同样，将微生物组权重阈值设为2.3，因为与大脑体素权重相比，它们更稀疏（这些结果的可视化参见图3）。
图3 每种数据的贡献比例结果显示在第一列（左）。第二列和第三列显示大脑模态的空间权重，例如，哪些体素与其他模态（脑网络和微生物丰度）中的相关性最强。第四列（右）显示与大脑网络中相关的微生物属。颜色与LICA（四个大脑网络和肠道微生物群）的模式一致。 微生物群占了成分1，3和6差异的大部分。DMN解释了组分7中的大多数差异，但微生物群的贡献比例超过0.2。按时间顺序讨论成分1、3、6和7。在大脑连接方面，LICA分析结果表现了哪些体素显示出被试各自网络的功能连接变化，这可以理解为网络连接强度的个体间差异。对于微生物群，LICA给出了该组分的肠道微生物群属的相对丰度权重在被试间的差异。 第一种成分（#1）在DMN和ECN以及微生物群的差异中占很高的比例。成分1中的ECN在ECN核心中枢的受试者之间有所不同，例如背侧扣带回、中额叶和上额叶回，可以解释功能连接强度或ECN的表达强度，并且这种表达强度与肠道微生物群相对丰度的变化有关。同样，对于DMN，成分1包含了DMN的后核心中枢（后扣带回和脾后皮质）的差异。随着两个网络功能连接的增加，微生物属Prevotella_9属丰度更高，Blautia属丰度更低。因此，在讨论中称之为ECN-DMN-Prevotella+-Blautia−成分。 第二种成分（#2）由于微生物群丰度和DMN的差异占比超过50%。随着DMN前侧脑区的功能连接增加，双歧杆菌丰度更高，Prevotella_9和拟杆菌较少。因此，在讨论中称之为DMN-Bifido+-Prevotella−成分。 成分6（#6）在所有成分中微生物群的贡献最大，约为75%，但也包含了双侧额顶叶注意网络中的差异。这些网络在该成分上的权重与它们在外侧额叶和顶叶脑区的结构重叠。因此，该成分再次与注意网络的功能强度的被试间差异有关。注意网络的表达增强时，Prevotella_9属，双歧杆菌、Lachnospiracaceae属、粪杆菌丰度较高，Christensenellacea_R-7_group属丰度较低。因此，在讨论中称之为FPN-Bifido-Prevotella成分。 成分7（#7）再次与DMN以及大约25%的微生物群差异有关。被试间差异的空间分布模式可以解释为DMN与所谓的突显网络脑区（例如背侧前扣带皮层（背侧ACC）和腹外侧前额叶皮层（VLPFC））的连接增强，这在以前的文献中结果与压力升高对DMN静息状态连接性的影响有关。Ruminocuccus_2属在DMN与背侧ACC和VPLFC的连接升高的个体中含量更高，而Blautia属则较少。因此，在讨论中称之为DMN-Ruminocuccus+-Blautia−成分。 在这项研究中，作者为健康人肠道微生物群和大脑网络连接之间的多变量关联模式提供了新的证据。使用一种新的多模态整合技术来解释四个脑网络中大脑连接和肠道微生物群的个体间差异。作者探索性的结果可以显示出指导未来肠道-大脑相互作用关系研究的巨大潜力。作者将ECN的功能连接与微生物Prevotella_9和Blautia属联系起来；DMN与Prevotella_9，Blautia，Ruminococcus_2，双歧杆菌和拟杆菌；额顶叶注意网络与Prevotella_9，双歧杆菌，粪杆菌，Christensenellacea_R-7_group以及属于毛螺旋菌科的某些属；压力相关的DMN网络功能连接与Ruminocuccus_2和Blautia菌群的丰度关联起来。各个成分与对应网络的空间分布显著相关性可以看作是对方法的验证。此外，作者还观察到四个成分中的三个成分的各自脑网络核心脑区的功能连接在被试间的差异与某些微生物群的相对丰度之间的联系。这些发现可以验证某些微生物属与四种静息态脑网络的被试间差异具有相关性。 关于与大脑网络连接相关的细菌属的结果，作者发现双歧杆菌属丰度的个体间差异与四种成分中的两个显著相关。双歧杆菌属的丰度变化与ECN-DMN-Prevotella+-Blautia−成分中DMN内侧前额叶皮层，和FPN-Bifido-Prevotella成分中额顶叶注意网络核心脑区的功能连接显著相关。双歧杆菌属可能是当前肠脑轴研究中最重要的靶点之一。这可能与一项具有里程碑意义的研究结果有关，该研究表明，无菌小鼠改变了HPA轴功能，并且这种改变能够通过双歧杆菌定植而恢复。双歧杆菌是发育过程中最重要和最丰富的微生物属之一，与人类发育过程中炎症水平的降低有关。长双歧杆菌是益生菌产品中常用的一种菌株，它能够影响静息态神经活动，与社会压力诱导任务中其活力增强和疲劳减少相关。内侧前额叶皮层和DMN与自传性回忆和情节记忆有关，这表明干预后双歧杆菌的增加与言语情景记忆增强之间存在联系。此外，Bagga及其同事还发现使用益生菌（包括B. longum）后DMN的功能连接发生改变的现象。因此，成分3可能部分反映了双歧杆菌和DMN功能连接中与情景记忆的相关关系。一项长双歧杆菌的实验，使用脑电记录生理静息状态，实验结果表明，与安慰剂相比，摄入益生菌后额叶活动增强和记忆力改善。作者将实验记录与注意力相关的大脑活动联系起来。此外，在我们分析的超过50个属中，四种成分中的两种成分中含有双歧杆菌，这一事实强调了它们在肠脑相互作用中的影响以及我们分析方法的有效性。总之，作者发现了双歧杆菌丰度与静息态注意力和潜在记忆相关的大脑网络活动的相关性证据。 对于DMN-Ruminocuccus+-Blautia−成分，关联的空间分布模式与社会应激诱导后DMN功能连接状态相似。在使用类似的数据中，长双歧杆菌能够调节受社会压力影响的脑区以及海马体（DMN的一部分）的活动。这种模式与Blautia和Ruminococcus 2丰度相关。虽然双歧杆菌与该成分没有共同作用，但双歧杆菌的摄入可能通过调节Blautia和Ruminococcus 2的丰度，间接影响了压力下的DMN的功能连接。事实上，Blautia和Ruminococcus 2的丰度与肥胖患者双歧杆菌干预的代谢结果相关。此外，Blautia已被发现是唯一在抑郁症大鼠模型中富集的微生物属。并且都与小鼠压力相关的抑郁样行为相关。总之，Blautia和Ruminococcus 2丰度的变化可能与应激诱导的DMN连接调节有关。 三种不同成分的大脑网络与Prevotella_9的关联很有趣，因为该微生物属以前曾认为与精神疾病，认知和大脑连接变化有关。例如，在以非典型脑网络组织为特征的自闭症谱系障碍（ASD）中（包括DMN和ECN，如成分1），Prevotella和双歧杆菌的相对丰度与微生物群移植疗法的有益作用有关。因此，Prevotella相对丰度较低与儿童ADHD，帕金森病和泛自闭症障碍等精神疾病有关。此外，肠脑轴可能在ASD的脑功能紊乱过程中发挥作用。作者发现Prevotella与DMN和ECN功能呈正相关，并且对额顶叶注意网络的功能调节也支持这些结果。以Prevotella为主的肠微生物亚型已被证明与ECN的功能网络内功能连接升高有关。此外，这种功能连接影响了执行控制任务中的反应时间，进一步支持ECN-DMN-Prevotella+-Blautia−成分和FPN-Bifido-Prevotella成分对执行控制和注意力的功能特性。作者的研究可能会通过区分与双歧杆菌和Prevotella相关的注意力以及与DMN关联和Blautia低丰度下的执行控制网络之间的划分来增加更多的成分。以前的工作已经报告了肠道微生物群与静息状态功能连接之间的联系。有趣的是，在一项评估双变量关系的研究中，Prevotella和拟杆菌的丰度与岛叶功能连接有关。岛叶不仅被认为是突显网络的一部分，而且也被认为是一般任务网络的重要组成部分。在本文的结果中，Prevotella和拟杆菌属都与成分3中的DMN网络连接呈负相关，结论与先前的结果一致。Prevotella似乎与注意力，认知控制，情景记忆和一系列其他心理功能相关的脑功能连接的健康调节有关。 本文的实验设计和方法在解释结果方面存在局限性。首先，这些发现必然局限于微生物中更常见的属。将分析限制在至少30%的受试者中可检测到的微生物属。个体中发现率较低的属可能对LICA结果具有强大影响力。由于这种方法学的选择，我们不能排除对常见微生物属的高估，也无法评估稀有属及其与大脑网络连接的关联。 其次，大脑网络的选择是根据它们在认知过程中的作用确定的，特别是对高级认知相关的脑区结构（如注意力和认知控制）以及它们在文献中的相关性。结果可能无法很好地涵盖其他认知过程和相关大脑网络。尽管如此，出于几个方法学原因，作者选择了这种预先选择大脑网络的方法：（1）希望使用以前已经很好地表征和理解的大脑网络连接，无论是在理论上（即它们的心理功能）还是在生理上（即时间同步BOLD激活的大规模大脑网络）。（2）使用相关矩阵作为输入的一个问题是，单个体素或一组分散的体素可能与肠道微生物群的相对丰度有关。认知神经科学远非理解那些单体素或分散的体素的相关模式，理解这些需要反向推理，这是该领域的一个巨大问题。（3）虽然整个大脑连接矩阵代表了神经元随时间变化的相关性，但尽管进行了严格的去噪，它仍将保留了伪相关性或噪声相关性。因此，本文的方法可以额外去除假阳性的相关性。（4）作者专注于选择的一组重要网络作为可能贡献比例大小的限制约束，但不以任何方式限制贡献的类型。这种方法是以数据为驱动的。 第三，作者调查了一个非常相似的，健康和年轻的女性群体。虽然这限制了结果的普遍性，但作者相信这组数据仍然具有导向作用，因此是有价值的。在重复实验中，应考虑样本的这种同质性和特殊性。因此有必要在更大和更多样化的样本中复制目前的结果。 总之，本文提供了第一个证据，证明健康女性个体样本中四个非常完善的大脑网络的大规模脑网络功能连接与肠道微生物群的相对丰度之间的多变量相关模式。此相关性为未来的研究提供了图谱，考虑到了这两组数据的全部复杂性。例如，旨在改善注意力的干预措施（例如神经发育障碍）可以调查对与注意网络相关的细菌属丰度的影响。此外，它可以提供一个方法，以研究益生菌干预试验的效果如何调节大脑网络（和相关认知功能）与肠道微生物组某些属的丰度变化有关。此外，未来的研究可能会进一步调查本文的多变量相关模式的机制原理，并旨在评估对其他健康样本的普遍性以及在患者大脑中的潜在破坏性。
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