|
1 分子克隆菌株 下文在介绍不同菌种的特性时，会首先列出每种菌株的基因型，如果你是初次看到细菌的基因型并且感到有些茫然也没有关系，我会把最关键的部分挑出来重点阐述。 所有适合做分子克隆的菌株基本都有两个共同的突变：endA1和recA1。endA1编码核酸内切酶I，具有该突变的菌种能够减少质粒被非特异性核酸内切酶降解，提高质粒的产量和质量；recA1编码ATP依赖的重组酶，缺失该基因能够降低质粒发生意外重组的概率（质粒内部重组或者与大肠杆菌基因组发生重组），大大提高了质粒的稳定性。但是克隆菌株都不具有lon和OmpT突变，这两个基因都编码了蛋白酶，而几乎所有的蛋白表达菌株都具有这两种突变，因此能够提高外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性。分子克隆菌株一般都可以非常方便地制作效率很高（>109 CFU/μg DNA）的化学转化感受态细胞和电转化感受态细胞。 DH5α抗性：无 菌落表型：光滑边缘 大质粒转化效率：<10% pUC19 DH5α是最常见的分子克隆菌株，但是我个人不用它已经很多年了，因为它有一些局限性，而且有更好的替代。菌种本身没有任何抗性基因是一个最大的缺点，这一点在人员众多且相互之间水平参差不齐的实验室尤为刺眼，因为制作感受态的过程很有可能受到不明来源的污染。生长速度很慢，pUC19质粒转化效率最高可以超过109 CFU/μg DNA，但是大质粒（>10 kb）的转化效率急剧下降，如果你用DH5α转化大质粒的连接产物经常得不到任何克隆很可能是这个原因。 抗性：链霉素 菌落表型：光滑边缘 大质粒转化效率：~30% pUC19 DH10B是DH5α菌株非常好的替代。链霉素抗性，制作感受态时可以大大降低污染概率。pUC19质粒转化效率最高可以超过109 CFU/μg DNA，nupG突变允许更大的质粒进入细胞，适合大质粒（>10 kb）的转化克隆。 TOP10抗性：链霉素 菌落表型：光滑边缘 大质粒转化效率：~30% pUC19 经典的分子克隆菌种，基因型与DH10B高度相似，事实上有观点认为TOP10与DH10B几乎不可区分，可以互相代替。我个人的经验，TOP10与DH10B不太一样，生长速度略有差异，蛋白表达特性更好。这里说的蛋白表达并不是指IPTG诱导的大量蛋白表达，而是有些能够持续低水平表达蛋白的质粒（非T7启动子、低拷贝数）在TOP10中可以很好地可溶表达，因为检测到了明显的下游产物，但是用DH10B就要差一些。链霉素抗性，制作感受态时可以大大降低污染概率。pUC19质粒转化效率最高可以超过109 CFU/μg DNA，nupG突变允许更大的质粒进入细胞，适合大质粒（>10 kb）的转化克隆。 抗性：链霉素 菌落表型：光滑边缘 大质粒转化效率：~30% pUC19 适用于含有ccdB毒性基因的质粒复制。很多Gateway质粒的att位点之间都含有ccdB毒性基因，当转化常规克隆菌种制作的感受态细胞时，没有克隆成功的质粒会导致宿主细胞死亡，从而实现低背景克隆。转化扩增这些质粒必须使用ccdB survival类似的菌株。 XL10抗性：四环素，氯霉素 菌落表型：粗糙边缘 大质粒转化效率：>30% pUC19 目前最喜欢用的主力克隆菌种，优点很多。生长速度快，四环素和氯霉素双抗性，感受态污染的可能性极低，大质粒转化效率高。特别的，XL10具有特殊的粗糙边缘菌落表型，与上述所有菌种都不一样，可以非常很容易地通过菌落形态辨别杂菌污染。还有一个我非常喜欢的隐性优点，提取质粒时加入P2溶液（氢氧化钠和SDS混合溶液）后菌悬液裂解彻底，表现为溶液高度透明，而上述所有菌种裂解之后都不能完全澄清，因此XL10的质粒产量更高。 抗性：无 商业化菌种中生长速度最快的菌种，按照NEB自己的宣传转化后6.5小时即可见菌落，单菌落培养4小时后即可提取质粒。注意，这个菌种只有endA1突变但是没有recA1突变，可能不适合复杂序列质粒的稳定扩增，不太推荐作为日常菌种使用。 所有适合蛋白表达的菌种都有lon和OmpT突变，这两个基因都编码了蛋白酶，这些突变能够提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性，提高蛋白的产量和完整度。但是蛋白表达菌种一般都没有endA1和recA1突变，且这些菌种制作的感受态效率通常都不高（<107 CFU/μg DNA），所以不能用作克隆菌种。 BL21抗性：无 兼容T7启动子：否 最基础的蛋白表达菌种，外源蛋白的表达量很高，但是只适合非T7启动子质粒的蛋白表达（pGEX-4T1、pMAL-c5X等），所有T7启动子的载体（pET全系列）都不能表达，原因是缺少λ噬菌体溶源片段DE3。大肠杆菌T7噬菌体T7启动子需要T7 RNA聚合酶才能启动转录，大肠杆菌本身没有T7聚合酶基因，具有DE3溶源片段的菌种都包含lacUV5启动子控制的T7聚合酶。 抗性：氯霉素 兼容T7启动子：否 BL21衍生菌种，基础的蛋白表达菌种，只适合非T7启动子质粒的蛋白表达（pGEX-4T1、pMAL-c5X等）。Rosetta系列菌种最大的特色是包含一个氯霉素抗性的质粒pRARE，额外补充了7种大肠杆菌稀有的密码子AGG, AGA, AUA, CUA, CCC和GGA，对应的tRNA基因是argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT, tyrU和thrU。这种特性使得Rosetta菌种特别适合表达真核生物的蛋白，尤其是BL21表达有困难的蛋白，因真核基因的密码子偏好性与大肠杆菌不同。 BL21(DE3)在各自原始菌种的基础上增加了DE3片段，兼容pET系列载体。 在上述DE3菌种的基础上增加了一个氯霉素抗性的质粒pLysS，对于Rosetta系列来说pLysS和pRARE质粒整合为一个质粒pLysSRARE。pLysS质粒以较低水平在细胞内表达T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的抑制剂，低水平地持续表达T7溶菌酶能够抑制未受IPTG诱导时有可能发生的背景表达，使得IPTG的调控更加严谨，这一特性使得这些菌种适合表达有一定毒性的蛋白。Rosetta2（DE3）pLysS是个人最喜欢用的菌种，用来表达植物蛋白可溶性通常比较高，菌落边缘粗糙，生长速度快，Bugbuster裂解菌液完全澄清，明显与BL21、Rosetta2等菌种区分。 BL21(DE3)pLysE在DE3菌种的基础上增加了一个氯霉素抗性的质粒pLysE，对于Rosetta系列来说pLysE和pRARE质粒整合为一个质粒pLysERARE。pLysE质粒以较高水平在细胞内表达T7溶菌酶，有效地抑制了泄露表达，使得IPTG的调控比pLysS系列更加严谨，这一特性使得这些菌种适合需要对蛋白表达精准调控的场景。 3 菌种操作注意事项 菌种的日常操作有很多需要注意的地方，其中头号问题就是需要比较严格的无菌操作，严防感受态细胞污染或者突变。从上文也可以看出，我个人非常重视菌种的抗性基因，没有抗性诸如DH5α在我看来就是严重的缺点，因为菌种划线、培养和制作感受态的过程中有无抗性会显著地影响感受态的纯度。如果你自制的感受态经常在平板上长出其他颜色、气味、大小的奇怪杂菌，需要高度怀疑菌种已经污染，推荐改用任何有抗性的菌种。 另外一个需要注意的是，菌种或者商业感受态买回来之后，应该立即划线，然后挑选单菌落在相应的抗性培养基中培养至饱和，然后保存菌种冻存-80℃，保存得当的甘油菌可以持续10年都有活性。千万不要每次制作感受态之后用当次的饱和菌种重新保存菌种，然后下一次制作感受态时从最新的菌种划线。这样做大大增加了菌种的增殖代数，会使菌种累计突变，繁殖数代之后菌种将面目全非。永远只从最原始的菌种划线！
|
|
|
来自： 访山品茗 > 《protocol》
