【原】单细胞水平解析人类杜普征氏掌挛缩病的间充质细胞

文章信息

题目：Deciphering Mesenchymal Drivers of Human Dupuytren’s Disease at Single-Cell Level
日期：2022-01
期刊：Journal of Investigative Dermatology
链接：https://www./science/article/pii/S0022202X21014536

摘要

杜普征氏掌挛缩病（Dupuytren disease，DD）是一种常见的纤维增生性疾病，影响手掌筋膜。这种患病筋膜的挛缩导致手指不可逆地向手掌弯曲。目前手术仍然是许多 DD 患者的首选治疗方法；然而，即使在有效的手术后，由于已建立的关节挛缩和复发率很高，患者可能会留下永久性功能障碍。

间充质是纤维化过程中病理基质沉积的主要来源，动物模型显示准确识别间充质细胞的特定亚群可以显着减少纤维化疾病的纤维化。本文对来自 DD 组织、健康真皮和非致病性筋膜进行单细胞转录组测序，得到了 35,250 个单细胞的转录组。描述了健康真皮和筋膜以及 DD 组织的单细胞图谱；发现了可能源自成纤维细胞 (FB)的致病性 PDPN⁺ 肌成纤维细胞(Myofib) 群体；发现 TNFRSF12A在致病性 PDPN⁺ Myofibs 上表达，预期可以作为治疗 DD 患者的治疗靶点。

健康和 DD 人体中真皮和筋膜的单细胞图谱

作者拿到了 DD 、非致病性筋膜（来自手掌腱膜的横韧带，在本文中称为 Skoog 筋膜）和健康真皮组织（n = 3 DD，n = 3 Skoog 筋膜，n = 3 健康真皮），质控后得到了35,250 个细胞，聚类分群得到18群，然后注释得到9类主要细胞类型。

CD68⁺ 单核吞噬细胞和 PECAM1⁺ 内皮细胞位于整个 DD 纤维化部位，PDGFRB⁺ 间充质细胞是最丰富的细胞类型

另外，根据 纤维状胶原蛋白的marker (COL1A1, COL1A2, and COL3A1)表达量来看，间充质细胞是纤维状胶原蛋白（I 型和 III 型）主要表达的细胞类型：

鉴定 DD 中的致病性间充质亚群

为了进一步研究间充质细胞的功能异质性并鉴定驱动 DD的促纤维化间充质细胞亚群，作者将间充质细胞重新聚类，得到出四个不同的亚群。其中cluster 1-3 由来自所有三个组织采样的细胞组成，而cluster  4 几乎完全由 DD 组织中分离的细胞构成。

结合marker基因的差异表达和免疫荧光，DD 内的间充质亚群被分为血管平滑肌细胞（c 1）、周细胞（c 2）、成纤维细胞（c 3）和肌纤维细胞（c 4）。

肌纤维细胞

PDPN⁺ 肌纤维细胞是DD 纤维化区域内的主要间充质细胞群，但在非致病性 Skoog 筋膜中未观察到。

纤维胶原蛋白marker（COL1A1、COL1A2、COL3A1）和Myofib 的marker（ACTA2）在c4肌纤维 中表达量最高。

富集分析显示肌纤维细胞的差异基因主要集中在胶原纤维组织、细胞外基质组织、创伤反应以及疤痕形成通路，侧面反映了分群的准确。

成纤维细胞

为了探索成纤维细胞中是否还有异质性群体，于是对这部分又分出了7个clusters，并且注释为：血管平滑肌细胞（c 1）、周细胞（c 6）、肌纤维（c 3）和 FB 1-4（c 2、4、5 和 7）

来自 DD 组织的 FB 先前已被别人证明存在三个主要子集，注释为PDPN⁺, CD34⁺, and ICAM1⁺ (IL6low and IL6high) FBs，这个结论和作者确定的FB亚群是一致的。

DD中 PDPN⁺ 肌纤维细胞的起源

为了探索DD中 PDPN⁺ 肌纤维细胞的起源，作者进行了拟时序分析（使用Slingshot）和RNA速率分析（使用scVelo）。

细胞动力学展示了PDGFRA⁺ FB 到致病性 PDPN⁺ Myofib 细胞群存在潜在分化，但没有观察到从血管平滑肌细胞或周细胞到 PDPN⁺ 肌纤维的变化。

从FB到Myofib的轨迹推断发现了5个表达模式的基因模块，前三个下调后两个上调。上调的模块4和5包含多个促纤维化基因，包括COL1A1、COL1A2、COL3A1、MMP2、TIMP2和ITGAV。

当仅使用从 DD 组织分离的细胞进行相同的轨迹分析时，作者观察到从PDGFRA⁺ FB 到致病性 PDPN⁺ 肌纤维的类似的分化轨迹和相关的促纤维化基因上调（。这些数据表明，DD 中的 PDPN⁺ 致病性 Myofib 亚群源自PDGFRA⁺ 筋膜 FB 群。

为了深入了解 FB 到 Myofib 转变的转录调控，作者对FB分化轨迹的特征基因和人类转录因子列表取交集，确定了 20 个沿着 FB 分化轨迹表达改变的转录因子，其中六个被上调——SOX4、FOXP1、AEBP1、MAFB、DMRT2、SCX。

其中SCX和DMRT2对促纤维化 PDPN⁺ Myofib 细胞群的特异性最高。SCX 在富含细胞外基质的组织（包括纤维化的人肺）中高度表达，之前已被证明在调节 FB 和 Myofib 表型中发挥重要作用。之后也在SCX敲除实验中进行了验证，表明转录因子 SCX 在致病性 DD 肌纤维表型的调节中具有重要的功能作用。

DD 中 PDPN⁺ 致病性肌纤维的治疗靶向

为了探索 DD 中潜在的抗纤维化药理学靶点，作者使用 CellPhoneDB对模块4、5进行细胞通讯，发现了26 个沿着 FB 激活轨迹上调的基因。

发现9种配体和受体对致病性 Myofib 群体表现出高度特异性，包括TNFRSF12A。并且免疫荧光染色也证实了TNFRSF12A 在 DD 组织中的 PDPN⁺ 致病性肌纤维上的表达。相反，TNFSF12（TNFRSF12A 的配体）在数据集中的多个细胞类型中广泛表达。

TNFSF12 可以诱导来自DD 组织的原发性 FAP⁺ 肌纤维的增殖和激活，这个过程可被 TNFRSF12A 阻断所抑制，表明 TNFSF12-TNFRSF12A 通路在致病性肌纤维的扩增和激活中具有重要的调节作用，并确定了治疗 DD 患者的潜在药理学靶点。

小结

本文使用 DD 组织和对照组织（非致病性筋膜和真皮）的 scRNA-seq 解析了驱动 DD 的致病性间充质亚群和分子机制，发现了抑制 TNFRSF12A 在 DD 患者的治疗中具有临床潜力。