|
1.通过质膜分析表征骨髓瘤细胞表面蛋白质组为了表征骨髓瘤的表面蛋白质组，作者使用了质膜分析技术。作者首先对10个基因分型的人类骨髓瘤细胞系进行了分析，以确定该技术在癌细胞中的可行性，然后对8个原发性骨髓瘤样本进行了分析。根据已发表的注释策略，该过程在每个细胞系中鉴定出平均1791个细胞表面蛋白质，每个原发性样本中鉴定出3206个细胞表面蛋白质。在后一次筛选中包含了2个细胞系，结果显示骨髓瘤细胞系和原发性骨髓瘤的表面蛋白质组在定性上非常相似，其中3213个蛋白质中有3207个在两者中都被鉴定出来。作者没有观察到新诊断或复发患者之间的差异表达蛋白质，尽管作者的数据集中只有2个接受治疗的患者。 2.基于向量的优先级排序将SEMA4A确定为骨髓瘤的新型治疗靶点B细胞成熟抗原（BCMA; TNFRSF17）、CD38和SLAMF7，这些在骨髓瘤中已经获得批准的靶点，都在前10个命中结果中找到，证实了作者方法的有效性。作者排名第一的靶点SEMA4A，在骨髓瘤中尚未被确定为靶点。因此，作者将其优先考虑进行进一步研究。SEMA4A是一种第4类信号素，作为可溶性配体参与胚胎和病理性血管生成以及免疫应答的微调，并可能在癌症中发挥作用。它还可以作为受体，通过其胞浆域发出信号来介导细胞迁移。作者的数据显示，SEMA4A在所有分析的细胞系和原始样本中均有表达，其水平高于SLAMF7或BCMA，但低于CD38。作者还检查了不确定意义的单克隆免疫球蛋白病和无症状骨髓瘤中的SEMA4A转录表达。在这些癌前病变和骨髓瘤之间，SEMA4A的表达没有差异，SEMA4A的表达也与潜在的细胞遗传学异常无关。整个细胞蛋白组学数据和组织微阵列数据都表明，在造血系统以外的部位表达较低。为了检查组织微阵列的敏感性，作者制备了已经进行过分析的几种细胞系的石蜡包埋细胞团，并使用相同的抗体对其进行染色。这表明，组织微阵列对SEMA4A的检测限度与流式细胞术的检测限度非常相似。因此，作者得出结论，SEMA4A在骨髓瘤细胞上表达水平较高，但在肿瘤以外的组织中表达较低，使其成为一个有前景的治疗靶点。
3.SEMA4A对于正常的骨髓瘤细胞生长是必需的细胞表面靶点的下调是免疫治疗抵抗的潜在机制。因此，作者通过携带慢病毒的shRNA来测试下调SEMA4A的效果，其中包括六个针对SEMA4A的shRNA和一个针对荧光素酶的对照shRNA。这些shRNA对不表达SEMA4A的K562细胞的生长没有影响，这意味着这些shRNA对细胞增殖没有非特异性影响。在骨髓瘤细胞系NCI-H929和MM1.S中，三个特异性SEMA4A的shRNA有效降低了SEMA4A的细胞表面表达，而对照shRNA和剩下的三个SEMA4A shRNA对表达几乎没有影响。降低目标表达的SEMA4A特异性shRNA在GFP竞争实验中也明显延缓了细胞生长，而不影响SEMA4A表达的shRNA对细胞生长几乎没有影响。SEMA4A表达的丧失先于细胞死亡。CRISPR/Cas9靶向SEMA4A也导致H929和INA6细胞的竞争性生长劣势，但对MM1.S细胞没有影响。然而，RNA测序揭示MM1.S细胞通过剪接外显子来补偿SEMA4A的丧失。这种补偿可能是CRISPR/Cas9靶向的一个人为因素，正如先前所述。事实上，CoMMpass数据集中仅有8个样本（0.86%）显示了这种新的剪接变体的任何证据。
4.SEMA4A被内化，因此是一个潜在的ADC为了检测SEMA4A从细胞表面脱落到血液中的程度，作者开发了一种酶联免疫吸附测定法，并测量了多发性骨髓瘤患者和健康对照组中可溶性SEMA4A的血清水平。稀释研究显示该测定法的检测限为2 ng/mL。健康对照组和多发性骨髓瘤患者的可溶性SEMA4A的中位数血清浓度分别为3.3 ng/mL和8.1 ng/mL。两组之间的差异显著（t检验，P = .0022）。然而，作者没有观察到多发性骨髓瘤肿瘤负荷或国际分期系统阶段与血清水平之间的任何关联。多发性骨髓瘤中可溶性SEMA4A的绝对水平极不可能干扰SEMA4A ADC在多发性骨髓瘤中的活性。例如，通过belantamab mafodotin或CAR T细胞靶向多发性骨髓瘤中的TNFRSF17（BCMA）时，中位数血清表达水平为176 ng/mL的可溶性BCMA并未受到影响。 综合这些数据，可以推测SEMA4A抗体可以被内化并转运到溶酶体，并且从细胞表面脱落的程度不太可能影响ADC的活性。 5.一种新型的SEMA4A ADC在体外杀死骨髓瘤细胞为了进一步探索SEMA4A作为ADC靶点，作者首先使用了Fab-ZAP测定法，使用了5E3 SEMA4A抗体。与未孵育的细胞或孵育了同位素对照抗体的细胞不同，孵育了5E3的骨髓瘤细胞系能够被与沙波林偶联的抗小鼠二抗高效杀死，其50%抑制浓度（IC50）在低皮克摩尔范围内。而不表达SEMA4A的K562红细胞白血病细胞，在孵育了5E3抗体并暴露于Fab-ZAP后没有受到影响。然后，作者使用已建立的连接剂化学方法，将5E3克隆抗体直接偶联到2种细胞内毒素，单甲基奥利斯塔汀E和美替西酮（DM1），分别制备了5E3-vedotin和5E3-emtansine。5E3-emtansine对所有骨髓瘤细胞系都具有毒性，其IC50范围为207.7皮摩尔至39.6纳摩尔。5E3-vedotin对10个骨髓瘤细胞系中的8个具有毒性，其IC50范围为98.0皮摩尔至1.4微摩尔。对于这两种偶联物，IC50与SEMA4A表面表达呈正相关。预期地，ADC的治疗导致caspase 3/7的裂解增加，证实它诱导了细胞凋亡。骨髓基质可以为骨髓瘤细胞提供保护，在体外可以通过骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞的共培养来模拟这种作用。共培养可以保护骨髓瘤细胞免受某些药物（如皮质类固醇）引起的细胞毒性作用。作者使用了这种基质细胞共培养系统，并确认它确实可以拯救地塞米松引起的细胞毒性。 6.一种新型的SEMA4A ADC在体内杀死骨髓瘤细胞为了模拟体内治疗，作者使用了2个独立的小鼠异种移植模型，通过尾静脉注射骨髓瘤细胞。在第-13天，作者将表达荧光素的人类骨髓瘤细胞系通过尾静脉注射到非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷的伽玛小鼠中，并通过体内成像确认了骨髓髓质骨髓瘤的建立。作者测试了5E3-vedotin的疗效，因为这种结合比5E3-emtansine更稳定。Trastuzumab-vedotin作为同种型控制物，用于非特异性结合和内化，因为Trastuzumab是针对ERBB2的人源化免疫球蛋白G1抗体，而骨髓瘤细胞上没有表达ERBB2。未结合的5E3克隆抗体作为额外的对照，以确保活性是由于抗体的内化和释放结合毒素所致。初始荧光素信号强度在5E3-vedotin注射组和对照组小鼠之间是相等的。出于实际原因，包括ADC有限，作者将给药限制在4次尾静脉注射，每周两次，持续2周。注射了5E3-vedotin的小鼠，在前两次注射后经历了缓解，通过抑制荧光素酶信号到背景水平。与对照小鼠相比，这导致了中位总生存期的显著增加。 至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：文章首先通过对初级人类骨髓瘤细胞的质膜进行分析，识别出了大量的细胞表面蛋白；第二部分，作者使用了一种新颖的方法来确定免疫治疗的目标，并发现了一种以前未在骨髓瘤中发现的细胞表面蛋白semaphorin-4A (SEMA4A)；第三部分，通过使用短发夹RNA和CRISPR/nuclease-dead Cas9 (dCas9)敲低SEMA4A的表达，研究者发现SEMA4A对正常的骨髓瘤细胞生长至关重要；第四部分，他们使用一种新的抗体-药物偶联物有效且选择性地针对SEMA4A进行了靶向。全篇知识点丰富，有很多值得作者深挖的生信分析的切入点，做免疫的小伙伴不要错过啦！ |
|
|
