血小板功能检测专题（5）：花生四烯酸途径生物活性物质和COX抑制剂的作用机理&信号传导

导语：关于抗血小板药物的介绍，这方面的文章很多。本文从血小板活化时的生物活性物质，受体，信号传导，以及抗血小板药物的机理等多个方面，综合汇总，希望能更好地理解这些活性物质及药物。

此外，血小板内部信号机制非常复杂，至今仍有很多机制不明确。

血管损伤后，首先会发生血管收缩，减少血流量。之后发生初级止血和二级止血，形成稳定的血凝块。

初级止血（Primary hemostasis）

在胶原和血流剪切等因素作用下，损伤部位附近的血小板被激活，血小板通过表面受体（GPⅠb受体）与vWF连接，形成血小板-GPIb/Ⅸ/Ⅴ-vWF复合物，使血小板粘附至损伤的血管胶原纤维表面。

血小板激活后，进一步释放ADP，TXA2，5-HT，钙离子等多种活性物质，造成更多血小板的活化，聚集，形成血小板栓子（Platelet plug）。

二级止血（Secondary Hemostasis）

胶原暴露，组织因子暴露，外源性/内源性途径凝血级联反应启动，顺序激活各种凝血因子，导致凝血酶（Thrombin）形成，催化纤维蛋白原(Fibrinogen)转化为纤维蛋白（Fibrin），并聚合形成网状（mesh），覆盖于血小板栓子表面，加强血小板栓子的强度。血小板伸出伪足，深入到网状结构之中，进一步强化栓子的稳定性。

同时，血管内皮细胞受损后，释放的NO和PGI2等抑制血小板聚集的活性物质也减少，进一步促进血栓的发生。

动脉血栓的形成中，血小板起到核心的作用，这与静脉血栓的形成是不同的。

针对已知的血小板激活过程中的各种关键酶、受体、激活剂、细胞内信使等环节，人们研发了很多药物，这些药物能够通过不同的作用机制，抑制血小板的聚集，因此被统一称为“抗血小板药”。

总体来说，抗血小板药物主要分为如下几类:

1、抑制血小板花生四烯酸代谢的药物;

1.      环氧化酶抑制剂（COX抑制剂）---代表药物：阿司匹林

2、作用于血小板膜受体和膜特异激动剂的药物;

     P2Y12受体抑制剂（也叫ADP受体抑制剂）---代表药物：氯吡格雷，普拉格雷，噻氯匹定，替格瑞洛。

     GPIIb/IIIa受体抑制剂 ---代表药物：阿昔单抗、替若非班、依替巴肽

3、影响血小板内cAMP代谢并增加其含量的药物。

1.       PDE抑制剂（也叫升cAMP的药物）---代表药物：西洛他唑、双嘧达莫（潘生丁）

2. 4、血栓素（TXA2）合成酶抑制剂---代表药物：奥扎格雷

3. 5、5-羟色胺受体拮抗剂---代表药物：沙格雷酯

4. 6、蛋白酶激活受体拮抗剂 （PAR）---代表药物：Vorapaxar

5. 7、其他靶点药物

每类抗血小板药物都具有自己独特作用机制和特点，我们逐步将会介绍。

抗血小板药物的作用靶点

首先介绍环氧化酶抑制剂（COX抑制剂），也叫NSAIDs(非甾体抗炎药）。

介绍药物之前，先了解一下花生四烯酸和前列腺素类物质。

1. 花生四烯酸途径及代谢物

花生四烯酸（AA，Arachidonic acid），以磷脂(Phospholipid)的形式存在于血小板细胞膜中。当细胞膜受到各种刺激时，可发生膜受体-配体的结合，触发磷脂酶A（PLA）活化。 

磷脂酶A（PLA）是一种细胞膜酶，能够水解各种磷脂和氨基醇，能够释放血小板细胞膜磷脂中的花生四烯酸（AA）进入血小板细胞质，并成为锚定在DTS（致密管状系统）中的环氧化酶（ COX ）的底物。

注：磷脂酶（Phospholipase）是一种将磷脂水解为脂肪酸及亲脂性物质的酵素。磷脂酶主要依据其催化反应的对象分为四类，即磷脂酶A、B、C、D 四种。

• 磷脂酶A（分为A1型和A2型）

磷脂酶A1－切SN-1酰基；磷脂酶A2－切SN-2酰基，释放出花生四烯酸

磷脂酶A2作用在完整的卵磷脂分子上，并水解在第二个碳上被酯化的脂肪酸，产生溶血磷酸（Lysolecithin）及脂肪酸。

• 磷脂酶B（分为B1型和B2型）

  磷脂酶B-切SN-1及SN-2的酰基；也称作溶血磷脂酶。

• 磷脂酶C

磷脂酶C－切的位置在磷酸盐基团前，并释放出diacylglycerol及一个前端含有磷酸根的基团。磷脂酶C在讯息传递扮演重要的脚色，放出第二信使:肌醇三磷酸（IP3）

• 磷脂酶D

磷脂酶D－切的位置在磷酸盐基团后，释放出磷脂酸及醇。

磷脂酶C及磷脂酶D都被认为是磷酸二脂酶。

磷脂酶作用靶点图

环氧化酶（COX）首先将 花生四烯酸（AA）转化为不稳定的 前列腺素G2（PGG2）和 前列腺素H2（PGH2），然后在血栓素合成酶等关键酶的作用下，进一步形成具有生物活性的 二十碳衍生物(Eicosanoids)，包括血栓素A2（TXA2），PGD2，PGE2， PGF2，PGI2等。

磷脂膜的分解及AA途径代谢物的生成

花生四烯酸途径代谢产物及作用效果

心血管系统中，最重要的三种类前列腺素物质，包括TXA2，PGI2，和PGE2。这些效应是通过与同源物GPCR受体结合，TXA2结合至TP受体，PGI2结合至IP受体，PGE2结合至EP1-4受体。PGI2的作用是通过特定的细胞表面IP受体介导的，该受体是G蛋白偶联受体基因超家族的成员，在激活后会通过直接刺激腺苷酸环化酶引起细胞内cAMP升高。

1.1 TXA2的作用机制

TXA2促进血管收缩，血管平滑肌细胞增殖以及血小板活化。

TXA2结合至膜受体TPα或TPβ，会导致致密管状系统（DTS）中钙离子的动员（Mobilization）。血小板细胞质中游离钙水平的增加，会引起肌动蛋白微丝（Actin Microfilaments）的收缩和血小板的活化。

TXA2 的细胞信号传导机制

• 血小板膜上存在TXA2受体，即TPα或TPβ。TXA2结合至受体后，激活Gq蛋白。Gq蛋白，可以沿着细胞膜移动，结合至一个特定的膜蛋白，即磷脂酶C（PLC），并导致磷脂酶C（PLC）激活。

  PLC被激活后，分解特定的膜结构PIP2（二磷酸磷脂酰肌醇），降解成为2种成分，分别为IP3（三磷酸肌醇）和DAG（二酯酰甘油）。（与ADP介导的P2Y1和P2Y12受体一致）

• IP3和DAG都属于细胞内的信使物质，能够通过血小板内的信号通路，介导血小板的活化过程。

  IP3如何发挥作用？

• IP3结合至像内质网一样的致密管状系统（DTS）受体，并刺激钙离子蛋白通道，允许钙离子移出DTS进入细胞质中，之后钙离子刺激血小板内的颗粒（致密颗粒，δ颗粒）与细胞膜融合，之后这些颗粒释放小分子活性物质，如ADP，5-HT，钙离子和TXA2等活性物质。

• 释放的ADP，TXA2，5-HT，ATP等活性物质，将进一步引起更多血小板的激活，并产生更多的血小板聚集。

  DAG如何发挥作用？

• DAG可以激活蛋白激酶C（PKC），之后PKC可以调节GPIIb/IIIa受体活性，并使不同血小板上的GPIIb/IIIa受体可以彼此连接（通过纤维蛋白原和vWF），造成血小板的聚集。

• DAG可以激活蛋白激酶C（PKC），使其磷酸化并调节多种下游效应分子，如肌动蛋白轻链激酶（MLCK）、整合素αIIbβ3、小G蛋白Rap1b等。

• DAG还可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，进一步调节血小板功能。

• 此外，DAG还可以与RasGRP结合，使其激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。

• 最终，可以调节GPIIb/IIIa受体活性，激活GPIIb/IIIa受体，暴露纤维蛋白原结合位点，导致血小板聚集。
  

1.2 PGI2的作用机制

PGI2和PGE2，有时候会起到跟TXA2相反的作用。PGI2促进血管扩张，抑制血管平滑肌细胞增殖，减少血小板活化。

TXA2和PGI2的细胞内信号传导

1.3 PGE2的作用机制

PGE2倾向于促进血管扩张，在低浓度时，它会增加血小板反应性，在高浓度抑制血小板反应性。

PGE2结合至不同的4个EP受体，这可能解释了PGE2在心血管不同的作用。

例如，激活EP1和EP3受体，与血管收缩相关；而激活EP2和EP4与血栓舒张有关。

在血小板上，激活EP3受体，可以抑制腺苷酸环化酶（AC，Adenylate cyclase），降低血小板内cAMP浓度，增加血小板的兴奋性。而激活EP4和EP2受体，可以增加血小板内cAMP的浓度，对抗、抵消EP3对血小板的激活。

高浓度的PGE2，很可能也会激活IP受体，通过激活腺苷酸环化酶（AC），升高cAMP浓度，从而抑制血小板的活性。

类前列腺素物质受体及信号传导通路（血管平滑肌&血小板）

循环中的TXA2主要产自于血小板，血管平滑肌细胞也能产生少量的TXA2。血小板除了产生TXA2，还能产生在一定程度上产生PGE2，但是不产生PGI2。

在生理环境下，大多数血管能够产生PGI2。血管内皮和血管平滑肌细胞，可以产生PGE2。

有报道称，血小板和内皮细胞之间可能会存在内过氧化物（Endoperoxides）的交换，这样，一种细胞就可以支持另外一种细胞产生类前列腺素物质（Prostanoid）。

提示：cAMP是血小板内部的一个重要的第二信使，任何原因引起的cAMP浓度升高，都会产生血小板的抑制。

腺苷酸环化酶（AC）的作用，是摄取ATP并把ATP转化为cAMP（环磷酸腺苷）, 之后，cAMP会激活蛋白激酶A（PKA），PKA继而会磷酸化血管扩张刺激蛋白（VASP），会把VASP磷酸化为VASP-P，并使之失去活性，导致GPIIb/IIIa受体激活，也就是说未被磷酸化的VASP，具有活性，可以抑制GPIIb/IIIa受体。

因此，花生四烯酸生成血栓素A2等活性物质的这个途径，也被称为花生四烯酸（AA）合成途径，或者称为前列腺素（Prostaglandin）途径、环氧化酶(COX)途径或血栓素A2途径，有跟多不同的叫法，但都是一个意思。

环氧化酶（COX, Cyclooxygenase）在体内有两种同工酶异构体，即COX-1和COX-2。两者都作用于花生四烯酸（AA），产生相同的代谢产物。

COX-1主要存在于血小板中，正常生理下介导前列腺素类物质的生成。

COX-2主要存在于炎症部位，可引起炎症反应、发热和疼痛。

因此，我们知道了，TXA2是导致血小板激活的重要物质，而环氧化酶（COX）是这个途径激活的关键酶。

那么，什么药物，能够抑制这个AA途径呢？如何抑制？

1. 阿司匹林（Aspirin）

1. 1阿司匹林的作用机制

阿司匹林（Aspirin），也称为乙酰水杨酸（Acetylsalicylic acid），是一种非甾体抗炎药（NSAIDs）。

阿司匹林可以使环氧化酶（COX）的丝氨酸（Serine）残基乙酰化（Acetylation），从而阻断COX催化位点与底物的结合，导致COX永久失活，血小板生成TXA2受到抑制，从而抑制由TXA2引起的血小板活化和聚集。

阿司匹林治疗后，TXA2引起的信号传导，向相反的方向发展

• 由于COX酶被阿司匹林抑制，产生更少的PGG2，PGH2，最终导致TXA2生成减少。

• 因此，在血小板内部，TXA2作用于TP受体后介导的Gq蛋白和PLC 的活化，都受到了抑制，IP3，DAG的产生都会减少。

• 之后IP3通路，对应的脱颗粒（Degranulation）也会减少，释放更少的活性分子，即5-HT， ADP，TXA2，钙离子等这些物质的释放，都会受到阿司匹林的抑制而减少，引起血小板更少的活化和聚集。

• 同理，在DAG通路上，PKC更少激活，也就相当于抑制了GPIIb/IIIa受体，导致血小板上的GPIIb/IIIa受体不能彼此连接，因此产生的血凝块，或者叫做血小板栓子，稳定性就差，抑制了血小板的聚集。

1.2 阿司匹林的作用特点：

• 阿司匹林对COX的抑制，并不是血小板特异性的，也能抑制内皮细胞中的COX。

• 阿司匹林对COX-1，COX-2都有抑制作用，以抑制COX-1为主。

• 因为血小板没有细胞核，不能重新合成COX酶，因此,阿司匹林对血小板的抑制是永久性的，直致血小板重新生成。

• 血小板的寿命是7-10天，每天约有10%的血小板重新生成。单次口服后，对聚集的影响持续约7天。

• 而内皮细胞具有细胞核，因此内皮细胞的COX失去活性后，可以在数小时内重新合成。因此，阿司匹林对内皮细胞PGI2合成的影响不大。PGI2，是很强的内源性血小板抑制剂，能抑制ADP、胶原等诱导的血小板聚集和释放。

• 血小板产生的TXA2和内皮细胞产生的PGI2之间的动态平衡，是调控血栓形成的重要机制。

1.3 阿司匹林的药物代谢学

• 阿司匹林的半衰期是15-20分钟，非常短。

• 可溶性阿司匹林在胃和小肠上段快速吸收，吸收后30-40分钟达到血浆峰值浓度，1小时左右，对血小板有明显的抑制作用。

• 而肠溶阿司匹林，在给药后3-4小时，血浆浓度达到峰值。如果是肠溶片，又需要快速起效，必须嚼服。

• 很小量的阿司匹林20-40mg/d, 就能抑制78%以上的TXA2生成。75-325mg/d可以对血小板的TXA2生成达到最大抑制，再增加剂量不会显著增加抗栓的作用，而表现为抗炎作用，不良反应也增加。

• 单次口服，至少需要160mg可溶性阿司匹林，在30分钟内，最大程度抑制血小板。

• 可溶性阿司匹林（每天40-80毫克）和肠溶阿司匹林（每天80-100毫克）具有累积效应，因此，通过4-5天，达到对血小板TXA2的形成的最大抑制（超过95%）。

• 停用阿司匹林后，当20%的血小板具有正常的环氧化酶活性时，就可以回复正常的止血功能。

2. 其他非甾体抗炎药（Other nonsteroidal anti-inflammatory drugs）

其他非甾体抗炎药物，包括布洛芬（ibuprofen），萘普生（naproxen），吡罗昔康（piroxicam），吲哚美辛（indomethacin），塞来昔布(celecoxib)等。

这些药物的 作用机制与阿司匹林相似，但对环氧化酶（COX）的作用是 可逆的，效果持续时间更短。

关于阿司匹林是否能够影响ADP对血小板的激活，这是一个非常有趣的问题。

结合下方的文献证据及建议，大家可以思考一下。

1，第十版威廉姆血液病手册：阿司匹林不仅可以抑制TXA2的生成，也能抑制其他激活剂，如胶原，ADP或肾上腺素引起的血小板激活。

2，国外文献：以LTA作为工具，以20μmol ADP诱导的最大聚集率（MAR）＜57%，作为接受P2Y12受体抑制剂治疗有效的标准。结果发现，在47名健康志愿者和98名只服用阿司匹林治疗的患者中，分别有7名（15%）和38名（38%），其ADP MAR＜57%，也就是意味着，这些人群，尽管没有服用P2Y12受体抑制剂，但是存在有类似P2Y12受体抑制剂治疗的效果。并且，接受阿司匹林治疗的患者，其ADP MAR＜57%的人群比例（38%），远高于健康志愿者（15%）。

所以，尽管人们对于阿司匹林进行了深入的研究，但是，仍然有一些机制，是不明确的。人们观察到了一些现象，但是还不能做出合理的解释。

篇幅所限，其他类型的抗血小板药物，逐步在后面的软文中进行介绍。

（完）

【参考文献】

1. Warner T D, Nylander S, Whatling C. Anti‐platelet therapy: cyclo‐oxygenase inhibition and the use of aspirin with particular regard to dual anti‐platelet therapy[J]. British journal of clinical pharmacology, 2011, 72(4): 619-633.

2. Hankey G J, Eikelboom J W. Antiplatelet drugs[J]. Medical journal of Australia, 2003, 178(11): 568-574.

3. Wijeyeratne Y D, Heptinstall S. Anti‐platelet therapy: ADP receptor antagonists[J]. British journal of clinical pharmacology, 2011, 72(4): 647-657.

感兴趣的朋友可以继续思考：1，只服用P2Y12受体抑制剂时候，对AA通路，有怎样的作用呢？协同？促进？2，同时服用阿司匹林和P2Y12抑制剂时，这两种药物，到底是如何作用的？哪些药物的效果会被抑制，减弱？哪些药物协同促进另外一种药物？这些问题，需要证据来解释。