 在之前的文章中，我们介绍了抗血小板药物中，重要的分类之一，即环氧化酶抑制剂(COX抑制剂），代表药物是阿司匹林。
ADP，即二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate)，是由一个分子腺苷与两个相连的磷酸根组成的化合物，属于一种核苷酸。是人们发现最早、也是体内诱导血小板聚集最重要的物质。 ADP的分子结构图和示意图
ADP可由血小板内部的致密颗粒（δ颗粒）所释放，也会在细胞和组织损伤时释放。与TXA2相比，ADP是一种弱激活剂（Weak agonist）。 一、ADP受体（ADP receptor） 在血小板表面，ADP可以与2种嘌呤受体（Purinergic receptor）相互作用，分别称为P2Y1受体和P2Y12受体。这些嘌呤受体，属于7次跨膜（7TM）受体家族，属于G蛋白偶联受体，统称为ADP受体。 ADP与P2Y1受体作用，主要负责启动（Initiate）血小板的反应 ADP与P2Y12受体相互作用可以促进P2Y1这种启动反应 封闭这两个受体中的任何一个，都可以降低ADP对血小板功能的刺激。 ADP刺激血小板后，最初的反应是发生变形(Shape change)，由圆盘状(Disk shape)变成一个由伪足（Pseudopodia）形成的球形（Spherical form）。 早期的这种变形反应，由P2Y1受体介导，涉及到钙离子内流（Influx），细胞质内钙离子动员（Mobilization），蛋白激酶C（PKC）激活和肌动蛋白聚合（Actin polymerization）等过程。 P2Y1受体激活后，导致迅速和短暂的血小板激活，说明P2Y1受体在血小板聚集的早期，发挥重要作用。有研究表明，P2Y1受体拮抗剂，对ADP诱导的腺苷酸环化酶（AC）抑制并没有效果，P2Y1受体不能充分地诱导所有与ADP相关的血小板聚集，说明一定有另外一种受体介导ADP对血小板的激活。 P2Y1受体是一种与Gq蛋白偶联的受体，在人类中由一个编码395个氨基酸残基的基因所编码。该受体在静息状态下就有一定水平地表达在人类的血小板上，在人类每个血小板约有1000到3000个受体分子，当ADP与该受体结合时，会引起Gq蛋白α亚基与βγ亚基分离而被激活，激活的Gqα亚基可以激活质膜上的磷脂酶C（PLC），使其水解磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），产生两个第二信使：肌醇三磷酸（IP3）和二乙酰甘油（DAG）。 IP3可以扩散血小板的致密管状系统上，并与IP3敏感钙离子通道结合而打开通道，使得致密管状系统内储存的钙离子释放到细胞质中。这样就引起了细胞内游离钙离子浓度的暂时性升高，游离钙离子浓度升高还可以促进血小板细胞膜上钙离子通道打开，并增加钙离子从细胞外流入，从而激活钙调素依赖性蛋白激酶等钙敏感性效应分子，并最终导致血小板脱颗粒，释放TXA2， ADP，ATP，5-HT，钙离子等活性物质。 此外，游离钙离子浓度升高还可以刺激线粒体摄取钙离子，并释放出线粒体ATP。线粒体ATP可以通过质膜上ATP结合转运蛋白（ABC）被释放到细胞外，并被水解为ADP或AMP。这样就形成了一个正反馈回路，使得更多的ADP能够与更多的血小板受体结合，从而增强了血小板的活化。 DAG可以激活血小板膜上的蛋白激酶C（PKC），使其磷酸化并调节多种下游效应分子，如肌动蛋白轻链激酶（MLCK）、整合素αIIbβ3、小G蛋白Rap1b等。 DAG还可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，进一步调节血小板功能。此外， DAG还可以与RasGRP结合，使其激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。 P2Y1受体介导的信号通路主要影响了血小板的形态变化和初级聚集。当ADP与P2Y1受体结合时，会引起血小板的形状从圆盘状变为球形，并伸出伪足，这是由于细胞内游离钙离子浓度升高和PKC活化导致的肌动蛋白-肌球蛋白收缩。同时，P2Y1受体还可以通过激活Rap1b和增加细胞内游离钙离子浓度而激活整合素αIIbβ3的配体结合功能，使得血小板能够与纤维蛋白原或其他血小板相互粘附，形成初级聚集。然而，P2Y1受体介导的聚集是不稳定和可逆的，需要P2Y12受体的协同作用才能维持和稳定。 反过来，P2Y12受体通过Gi介导的抑制腺苷酸环化酶（AC）的作用，和另一种不太明确的PI3-K（磷酸肌醇-3-激酶）的激活，进一步完成P2Y1受体启动的血小板聚集反应。 2、P2Y12受体 ADP与P2Y12受体的相互作用导致腺苷酸环化酶（AC，Adenylate cyclase）的抑制，伴随血小板聚集，后者通过血小板表面糖蛋白复合物（称为GPIIb/IIIa复合物）构象的变化(Conformation change) 来介导，从而使其成为纤维蛋白原的受体。(Figure 1)
Figure 1 血小板聚集中所涉及的一些受体和途径。显示了P2Y1或者P2Y12受体拮抗剂的作用靶点和阿司匹林抑制血小板聚集的靶点。 纤维蛋白原是血浆中高浓度存在的二价分子（Bivalent
molecule），一旦纤维蛋白原与单个血小板上的GPIIb/IIIa复合物结合，就会将相邻血小板上的GPIIb/IIIa连接在一起，结果是单个血小板转化为大量血小板（A large mass），导致数十万个血小板聚集在一起。 ADP与P2Y12受体结合后的信号传导机制 ADP与血小板P2Y12受体相结合，至少可以通过2个G蛋白偶联受体，引发血小板内信号传导发生改变，从而导致血小板聚集。（注：或许还有其他通路机制） 因此，ADP与P2Y12受体结合后，通过Gi蛋白及后续的酶激活反应，顺序地抑制腺苷酸环化酶（AC），更少的cAMP含量，更少的蛋白激酶A（PKA），更少的磷酸化血管扩张刺激蛋白（VASP），可以刺激GPIIb/IIIa受体，从而产生血小板之间的连接和聚集。 ADP与P2Y12受体结合后，Gq激活蛋白被激活后，可以激活磷脂酶C（PLC）。之后PLC可以分解磷酯酰肌醇二磷酸PIP2，产生IP3和DAG。 磷酯酰肌醇二磷酸（PIP2）是一种细胞膜中常见的磷脂。它由肌醇和磷酸酰基组成，具有重要的信号传导功能。 在细胞内，PIP2参与多种细胞信号转导通路的调控。它可以通过酶的作用被水解为两个次级信号分子：肌醇三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3可以刺激细胞内储存的钙离子释放，参与钙信号传递过程；DAG则作为第二信使激活蛋白激酶C（PKC），进而调控细胞的生理功能。此外，PIP2还与许多细胞膜上的信号转导蛋白相互作用，参与调节细胞内信号网络。它在神经递质释放、胞内器官的运动和分裂等细胞过程中发挥着重要的作用。总之，磷酯酰肌醇二磷酸（PIP2）在细胞信号传导和调控中具有重要的功能，是细胞内信号网络的关键分子之一。 IP3可以结合至DTS（致密管状系统）上的受体，引起钙离子释放，并最终导致血小板脱颗粒（Degranulation），释放TXA2， ADP，ATP，5-HT，钙离子等活性物质，引起血小板聚集（与花生四烯酸代谢后产生的TXA2，作用于TP受体后的通路机制相同） DAG也会激活蛋白激酶C（PKC），而PKC被激活后，可以调节GPIIb/IIIa受体的活性，进而引起血小板之间通过GPIIb/IIIa受体，相互连接，产生聚集。 P2Y12受体是一种与Gi蛋白偶联的（G Protein-Coupled Receptor GPCR）的受体，在人类中由一个编码342个氨基酸残基的基因（P2RY12）所编码。该受体在静息状态下也有一定水平地表达在人类血小板上，在人类每个血小板约有3000到6000个受体分子，当ADP与该受体结合时，会引起Gi蛋白α亚基与GDP交换成GTP，并与βγ亚基分离而被激活。激活的Giα亚基可以抑制质膜上的腺苷酸环化酶（AC），使其降低环磷酸腺苷（cAMP）的生成。cAMP是一种重要的第二信使，它可以通过激活cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）而调节多种下游效应分子，如磷酸二酯酶（PDE）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）、Akt、甘油醛-3-磷酸去氢酶等。因此，P2Y12受体通过抑制腺苷酸环化酶（AC）而降低环磷酸腺苷（cAMP）水平，从而抑制了cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）的活性，并增强了这些效应分子的功能。 P2Y12受体介导的信号通路主要影响了血小板的稳定聚集和颗粒释放。当ADP与P2Y12受体结合时，会引起血小板内外cAMP水平下降，并抑制了cAMP对血小板功能的负调节作用。这样就增强了整合素αIIbβ3的配体结合功能，并促进了纤维蛋白原交联介导的血小板聚集。同时，P2Y12受体还可以通过激活PI3K/Akt信号通路而促进血小板中密颗粒和α颗粒的释放，从而释放出更多的ADP、TXA2、5-HT、PDGF等可溶性激活因子或生长因子，进一步增强和扩大了血小板聚集，并促进了血管平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖和迁移。 1.3 P2X1 受体 在细胞和组织损伤后，ADP与ATP（三磷酸腺苷）一起出现在循环中。通过CD39对内皮细胞和白细胞的作用，ATP也可以产生ADP。
ATP转化为ADP的过程，伴随能量的释放
ATP和ADP之间的循环转化 ATP本身也可以在某些条件下通过与另一种嘌呤能受体（P2X1受体）相互作用促进血小板功能。（注：ATP和P2X1的作用，非本文重点内容，具体略） ADP放大其他血小板活性物质的作用（类似一种正循环）
在所有这些机制共同作用下，最终导致止血、血栓形成和炎症。因此，ADP通过P2Y1和P2Y12受体对血小板功能起重要作用。降低ADP在其中任何一种受体作用的药物都可以提供有效的抗血栓治疗。 二、 ADP受体拮抗剂（ADP receptor antagonist） 2.1 P2Y1受体拮抗剂（P2Y1 antagonist） 对P2Y1基因敲除小鼠（P2Y1 knockout mice）的研究表明，缺少P2Y1受体会导致ADP诱导的血小板聚集受损，并抵抗血栓栓塞（Resistance to Thromboembolism）。 已经确定了许多作为血小板P2Y1拮抗剂的药物，如A2P5P，A3P5P等。实验研究表明，这些拮抗剂，对ADP引起的血小板激活和聚集有明显的抑制作用。然而，鉴于P2Y1受体在身体其他组织中普遍表达（Ubiquitous expression），P2Y1受体作为抗血栓靶点的临床潜力值得怀疑。 尚未有临床研究评估P2Y1受体拮抗剂（P2Y1 antagonist）作为抗血栓药物，在人类受试者中的应用。 2.2 P2Y12 受体拮抗剂（P2Y12 antagonist） 有几种药物与血小板上的P2Y12受体相互作用，从而降低血小板功能。一些已经被用作抗血栓药物，另一些正在开发中，这些药物，统称为P2Y12受体抑制剂（P2Y12 receptor inhibitor）或者P2Y12受体拮抗剂（P1Y12 receptor antagonist）。 P2Y12受体抑制剂作对细胞信号传导造成的影响
P2Y12抑制剂包括主要包含两大类药物：
第一大类，P2Y12受体抑制剂（噻吩并吡啶类，Thienopyridine） 1. 噻氯匹定 （Ticlopidine） 噻氯匹定（Ticlopidine）属于第一代噻吩并吡啶类（Thienopyridine）药物，也属于无活性前体药（Prodrug）。 由于血液学副作用的高发生率，包括血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、中性粒细胞减少（Neutropenia）和再生障碍性贫血（Aplastic anemia），噻氯匹定已逐渐退出临床使用。 2. 氯吡格雷（Clopidogrel） 氯吡格雷属于第二代噻吩并吡啶类（Thienopyridine）药物，是目前使用最广泛的P2Y12受体抑制剂，属于无活性前体药（Prodrug），口服后对血小板的影响来自体内产生的活性代谢物（Metabolite）。 活性代谢产物（Metabolite），不可逆地与P2Y12受体结合，使受体无法对ADP作出反应，从而阻断P2Y12依赖激活的血小板膜糖蛋白（GPIIb/IIIa）复合物，抑制血小板功能，有效减少ADP介导的血小板激活和聚集。 注：这种不可逆效应是由于活性代谢产物与P2Y12受体内的半胱氨酸巯基残基(cysteine sulphydryl residues）共价结合（Covalent binding）所致。其对血小板功能的影响持续到受影响血小板的生命周期，即7至10天。 氯吡格雷的缺点：1，起效慢；2，作用效果的个体化差异。 在标准治疗开始后，其作为血小板功能抑制剂的作用开始相当缓慢，需要几天时间才能完全发挥作用。 对血小板功能的抑制作用在不同的人群中是不同的，一些患者尽管接受了治疗，但仍有较高的血小板反应性。 多种因素可能导致氯吡格雷治疗下血小板反应性升高 -个体内差异：长期治疗期间氯吡格雷的反应也会存在个体内差异（Intra-individual variability）。 氯吡格雷治疗下的血小板高反应性(High on-clopidogrel platelet reactivity) 已被证明是不良血栓结局的重要预测因子。因此，在临床实践中充分解决这一问题非常重要。不幸的是，尽管存在一些基因关联，但由于涉及多个因素，预测个体对氯吡格雷的反应并不容易。 血小板功能检测方法现在可以用来确定抗血小板作用的程度。在未来，血小板功能测试可能会成为强制性的，确定哪些患者正在接受氯吡格雷的充分治疗，哪些患者可能尝试更大剂量的氯吡格雷，哪些患者最好接受更新、更昂贵的抗血小板剂。根据每个患者的反应，使用血小板功能测试来定制治疗，可能为未来的抗血小板治疗提供一种经济有效的策略。
3. 普拉格雷（Prasugrel） （中国未上市） 普拉格雷（Prasugrel）属于第三代噻吩并吡啶类药物（Thienopyridine），因此，与氯吡格雷一样，也是前体药（Prodrug）需要转化为活性代谢物（Metabolite）以抑制血小板功能。 与氯吡格雷一样，普拉格雷活性代谢物与P2Y12受体中的半胱氨酸巯基残基（cysteine sulphydryl residues）不可逆转地结合，使受体无法对ADP作出反应，并在血小板的生命周期内抑制血小板功能。 然而，普拉格雷与氯吡格雷的不同之处在于，口服普拉格雷（Prasugrel）后，其起效更快，在个体患者中实现了更大、更一致的血小板抑制，因此其抗血小板作用更容易预测。 这主要是因为该药物的代谢与氯吡格雷的代谢不同，产生的活性代谢物的数量更大、更可预测。例如，CYP2C9和CYP2C19基因的多态性不会影响普拉格雷的代谢，这与上述氯吡格雷的代谢不同。 注：在国外，普拉格雷的零售价格大约是普通氯吡格雷的10倍，这也限制了普拉格雷在临床的广泛应用。 第二大类，P2Y12受体抑制剂（非噻吩并吡啶类，Non-thienopyridine） 1. 替卡格雷（Ticagrelor） 替卡格雷（Ticagrelor）也叫做AZD6140，在国内一般习惯称之为“替格瑞洛”，属于第一代，非噻吩并吡啶类P2Y12受体抑制剂。 替格瑞洛（Ticagrelor）的分子结构，与氯吡格雷和普拉格雷截然不同，是一种环戊基三唑嘧啶，也被称为ATP类似物（ATP analogue）。这种ATP类似物可以直接作用于P2Y12受体的抑制剂，不需要CYP450的活化。 替格瑞洛（Ticagrelor）的作用特点： 1.1 直接起效：替格瑞洛（Ticagrelor）也会被代谢并形成活性代谢物（Metabolite）ARC124910XX，但是，这种代谢物的药代动力学与母体化合物非常相似。 替格瑞洛（Ticagrelor）与血小板上的P2Y12受体相互作用，使其无法与ADP相互作用，但是，药物不一定需要代谢转化才能与受体相互作用。这可能至少部分解释了替卡格雷对患者的疗效高于氯吡格雷，而与肝酶活性的遗传差异无关。 1.2 可逆作用：替格瑞洛及其代谢物对P2Y12受体的抑制作用是可逆的(Reversible)。因此，一旦药物从循环中清除后，血液中的浓度降低，替格瑞洛就不能再抑制血小板功能。 1.3 起效迅速：由于替格瑞洛在口服后被迅速吸收，因此血小板抑制的发生是迅速且可预测的。 1.4 清除速度慢：尽管其作用模式是可逆的，但其关闭速度惊人地非常慢。尽管在给药后24小时，残余血小板抑制率低于50%，但在第3天仍有约20%的抑制率。这可能是因为替格瑞洛与循环中的血浆蛋白结合，从而降低其从血液中的清除率。 1.5 更有效的抗血栓作用：与氯吡格雷相比，替格瑞洛具有更有效的抗血栓作用，且无论是在治疗开始时还是在维持治疗期间，替格瑞洛的抗血小板作用都比氯吡格雷更大、更一致（PLATO研究，具体略）。 1.6 药物-药物作用：与氯吡格雷一样，替格瑞洛也是CYP450底物，因此也可能存在药物-药物相互作用。（母体药物可以不经过CYP450代谢，也可以经过CYP450代谢） PLATO研究结果显示出地域差异性（Geographical variation ）。在北美入组的患者中，替格瑞洛的益处似乎减弱了。造成这种差异的原因尚不清楚。 与世界其他地区相比，北美患者使用的阿司匹林剂量更高。大剂量阿司匹林可能会抑制血小板功能天然调节剂（Natural modulators）的合成，如血管前列腺素(Vascular prostaglandins)、PGI2、PGD2和PGE2，而研究表明，P2Y12拮抗剂可以促进这些血小板功能天然调节剂的抑制作用。这种与大剂量阿司匹林相互作用的可能性可以解释北美亚组抗血栓疗效降低的原因，值得仔细考虑。当然，这可能只是偶然的结果，但也可能涉及地理上的混杂因素。 副反应：与氯吡格雷治疗组相比，替格瑞洛治疗组的不良反应是呼吸困难发生率增加。 2. 坎格瑞洛（Cangrelor） 坎格瑞洛（Cangrelor），也叫坎格雷洛，也称为AR-C69931MX。 与替格瑞洛相同，坎格瑞洛也是一种环戊基三唑嘧啶，也被称为ATP类似物(ATP analogue)，不需要前体，可直接抑制P2Y12受体。 此外，与替格瑞洛相似，Cangrelor也是可逆的。 然而，与替格瑞洛不同的是，坎格瑞洛（坎格雷洛）不能口服，只能用于静脉注射。 坎格瑞洛（Cangrelor）的半衰期很短，其对血小板功能的影响在输注后几分钟内消失。因此，该药物可能是一种有用的治疗工具，可根据临床需要在规定的时间段内实现靶向抗血小板覆盖。 需要注意的是，当Cangrelor 与P2Y12受体相互作用时，它会限制氯吡格雷和普拉格雷的活性成分对P2Y12受体的不可逆抑制作用。 当静脉应用坎格瑞洛（Cangrelor），需要换成口服口服氯吡格雷或者普拉格雷时，如果血液中还有坎格瑞洛（Cangrelor）在起作用，那么氯吡格雷和普拉格雷的活性成分，将不能抑制P2Y12受体。如果等Cangrelor停药后，P2Y12受体不再被抑制，之后再给予口服的氯吡格雷或普拉格雷，这样，就会存在一个空档期，即P2Y12受体，会有一个时间段，不被任何药物抑制。这个空档期，可能会增加血栓的风险。 不同的P2Y12受体拮抗剂之间互相转换时，需要更多的研究，确定换药的时机和顺序。 3. 埃利诺格雷（Elinogrel） 埃利诺格雷（Elinogrel），这是一种新的P2Y12受体拮抗剂，也叫PRT060128或者 PRT128，属于第三代，直接作用、可逆的、竞争性P2Y12受体抑制剂。 埃利诺格雷（Elinogrel）分子结构属于一种喹唑啉-2,4-二酮，是一种磺脲衍生物。这是目前开发的第一种可作为口服和静脉注射药物使用的P2Y12拮抗剂。 这种药物尚处于相对早期的开发阶段。在新的II期试验中，INNOVATE PCI研究中，有报道称，与氯吡格雷相比，在稳定期心脏病患者接受PCI的患者中，静脉注射和口服形式的埃利诺格雷（Elinogrel）能够产生更大、更快的抗血小板作用。 然而，在临床试验中，埃利诺格雷（Elinogrel）和氯吡格雷相比，未显示出任何的临床疗效方面差异。 这可能是由于研究中对疗效结果的统计能力不足。令人鼓舞的是，我们注意到，在使用埃利诺格雷（Elinogrel）时，在小的出血或者大的出血方面，没发现太大问题。在围术期使用，轻微出血是与剂量增加相依赖的。 其他材料： 在临床中，有很多的药物名称，跟“氯吡格雷”的名字很相似，都包含“格雷”两个字，但是，这些药物却与氯吡格雷，有巨大的差别，并非属于P2Y12受体抑制剂。 阿那格雷（Anagrelide），作为“代表”氯吡格雷的同期药物，作用靶点却不是P2Y12，而是磷酸二酯酶PDE III的抑制剂。 阿那格雷，在高浓度时可抑制血小板的生成和聚集。本药原用作抑制血小板聚集，有抗血栓效果，但近年应用低剂量时发现其有降低血小板作用。作用机制可能是影响巨核细胞细胞周期后期(有丝分裂后)分化成熟，使血小板生成减少。因此，用于治疗骨髓增生性疾病激发的血小板增多症，可降低血小板计数升高和血栓风险，并改善相应症状包括血栓出血事件。 奥扎格雷（Ozagrel），它的作用靶点既不是P2Y12，又不是PDE，而是血栓素合成酶，且是世界上第一个上市的血栓素合成酶抑制剂。奥扎格雷可以特异的抑制体内TXA2合成酶，从而抑制TXA2产生，但不影响体内过氧化物生成，因此不影响血管内皮细胞合成PGI2。因此，可以使TXA2下降，PGI2增加，改善了TXA2和PGI2的平衡关系，起到抑制血小板聚集的作用。 以上我们已经看到，所有讨论的药物都有一个共同的作用机制，即它们与血小板上的P2Y12受体相互作用，降低ADP与该受体相互作用的能力，从而降低血小板功能。 因此，ADP本身引起的血小板激活，能够被P2Y12受体抑制显著抑制。同时，胶原和凝血酶刺激血小板后释放的ADP对血小板P2Y12受体的激活，也能够被显著抑制，从而整体影响血小板的功能。 P2Y12拮抗剂可减少血小板聚集、血小板分泌、血小板-白细胞相互作用以及血小板对凝血的贡献。P2Y12拮抗剂还可减少血小板合成TXA2，从而降低这些分子介导的血小板功能的放大作用。 在后期的文章中，我们会将继续介绍，
阿司匹林和P2Y12受体抑制剂之间的相互作用？ 全球血小板功能检测工具剖析？ 血小板功能检测试验中所用到的激活剂？ 敬请关注，咱们后边接着聊。 （完） 【参考文献】 |
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