高考要求
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实 验
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要 求
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（1）微生物的分离和培养
（2）某种微生物数量的测定
（3）培养基对微生物的选择作用 （4)利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用
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掌握程度参考本考试大纲中的：
一、考核目标与要求
2．实验与探究能力
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知识整合
一、培养基
1.定义：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质――培养基。
2. 培养基的类型及其应用：
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标准
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培养基类型
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配制特点
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主要应用
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物理性质
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固体培养基
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加入琼脂较多
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菌种分离,鉴定,计数
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半固体培养基
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加入琼脂较少
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菌种保存
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液体培养基
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不加入琼脂
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工业生产，连续培养
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化学组成
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合成培养基
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由已知成分配制而成，培养基成分明确
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菌种分类、鉴定
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天然培养基
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由天然成分配制而成，培养基成分不明确
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工业生，产降低成本
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目的用途
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鉴别培养基
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添加某种指示剂或化学药剂
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菌种的鉴别
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选择培养基
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添加（或缺少）某种化学成分
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菌种的分离
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3.微生物培养基中的营养
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水
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无机盐
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碳源
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氮源
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生长因子
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概
念
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供给微生物碳素营养的物质
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能被微生物吸收利用的含氮物质
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某些微生物生长所必需的少量物质
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来
源
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磷酸盐、硫酸盐、钾、钠、钙、镁、铁等盐类
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无机碳:CO2、NaHCO3等
有机碳源：糖类（最常）、脂肪酸、花生粉饼、石油等
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无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐等
有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉等
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维生素、氨基酸、碱基、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液（肝脏浸出液、麦芽汁）
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作
用
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微生物细胞的组成成分，溶解物质，生物化学反应的介质
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为微生物生长繁殖及其一系列生命活动提供不可缺少的矿质元素
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要用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物;异养微生物的主要能源物质.
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主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物。
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一般是酶和核酸的组成成分。
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说
明
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不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大，而且微生物对碳源的需求量最大。
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异养微生物：含C、H、O、N的化合物既是碳源又是氮源
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微生物之所以要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限
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4.微生物和动物、植物营养要素的比较
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生物类型
营养要素
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动物
（异养）
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微生物
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绿色植物
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异养
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自养
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碳源
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糖类脂肪
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糖、醇、有机酸等
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二氧化碳、碳酸盐等
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二氧化碳、碳酸盐
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氮源
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蛋白质或其降解物
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蛋白质或其降解物、有机氮化物、无机氮化物、氮
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无机氮化物、氮
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无机氮化物
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能源
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与碳源相同
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与碳源相同
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氧化有机物或利用光能
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利用光能
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生长因子
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维生素
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一部分需要生长因子
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不需要
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不需要
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无机元素
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无机盐
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无机盐
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无机盐
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无机盐
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水分
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水
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水
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水
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水
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5.微生物营养类型
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营养类型
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主要或唯一碳源
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能源
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代表菌
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光能自养型
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CO2
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光能
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蓝细菌
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光能异养型
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有机物
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光能
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红螺菌
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化能自养型
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CO2
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无机物
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硝化细菌
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化能异养型
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有机物
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有机物
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大肠杆菌
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6.培养基的配制原则：
①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
二、无菌技术
1.无菌技术的内容
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触
2.消毒和灭菌的区别
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条 件
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结 果
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能否消灭芽孢和孢子
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常用方法
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消毒
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较为温和的物理或化学方法
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杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
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不能
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煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂消毒法等
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灭菌
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强烈的理化因素
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杀死物体内外所有微生物
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能
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高压蒸汽灭菌法
干热灭菌法
灼烧灭菌法
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3.常见消毒灭菌方法比较
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方 法
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操作过程
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应用范围
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消
毒
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煮沸消毒法
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100℃煮沸5～6min
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日常生活中广泛使用
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巴氏消毒法
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60～80℃下处理15～30min
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牛奶、啤酒、果酒和果酱等不宜进行高温消毒的液体
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化学药物消毒法
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用体积分数为70～75%的乙醇、碘酒涂抹，来速水喷洒等
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用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
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紫外线消毒法
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30W紫外灯照射30min
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接种室空气
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灭
菌
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灼烧灭菌法
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酒精灯火焰灼烧
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微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等，接种过程中试管口活锥形瓶瓶口等
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干热灭菌法
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电热鼓风干燥箱160～170℃加热1～2h
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玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡是不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品。
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高压蒸汽灭菌法
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100kPa、121℃维持15～30min
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培养基及多种器材、物品
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4. 原理：在高温高压、化学药剂、强酸强碱作用下，使微生物蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。
三、实验操作
1.微生物培养、分离、计数和鉴定比较
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大肠杆菌纯化培养
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土样中分解尿素的细菌的分离与计数
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分解纤维素微生物的分离
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实
验
原
理
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1.培养基配制原理：微生物生长繁殖时需要各种营养物质，一般包括水、无机盐、碳源和氮源，有的还需要少量特殊营养物质（生长因子）。根据微生物的种类和实验目的不同，选择不同的原料配制不同培养基，配后要及时灭菌。本课题使用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，也称普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为细菌提供碳源和能源，磷酸盐；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入琼脂作凝固剂。在培养细菌时要用稀酸或稀碱将pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方见人教版选修1教材P.15。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。
2. 无菌操作原理：针对不同对象采用不同的消毒和灭菌的方法，在高温、高压、化学药剂、强酸和强碱作用下，使微生物蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。本实验采用酒精对实验者双手消毒，紫外线对操作环境照射消毒，对培养基采用高压蒸汽灭菌，对玻璃器皿进行干热灭菌和接种环灼烧灭菌等。
3. 纯化大肠杆菌的原理：为了获得大肠杆菌的纯培养，选用平板划线法或稀释涂布平板法，在牛肉膏蛋白胨培养基上操作，在培养基上将大肠杆菌稀释或分散成单个细胞，经培养后可分离得到由单个细胞繁殖而来的子细胞群，即菌落。这个菌落就是一个纯化的细菌菌落，这样就达到分离纯化的目的。
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1.分解尿素细菌的筛选原理：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为惟一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
2.统计菌落数目原理：
（1）直接计数法：这种方法是指利用特定的细菌计数板或者血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个面积为1 mm2和高0.1 mm的计数室，该计数室又均分成400个小格。测量时将稀释的样品滴加在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下数出每个小格所含的细菌的平均数，再按下面的公式求出每毫升样品所含的细菌数。
每毫升原液所含的细菌数＝每小格平均细菌数×400×1 000×稀释倍数（此方法的缺点是分不清活菌和死菌。）
2.间接计数法
稀释涂布平板法，常用来统计样品中的活菌数，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。计算公式：每克样品中的菌落数=（某稀释度下平板上生长的平均菌落数c÷涂布平板时所用的稀释液的体积v）×稀释倍数M.。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是如果稀释的倍数不够大，很可能出现两个或者更多的细菌在一起共同形成一个菌落的情况，在最后计算时，我们却是按照一个细菌来计算的。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
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刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理:刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
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实
验
流
程
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1. 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板
2.纯化大肠杆菌
平板划线操作和稀释涂布平板操作→培养
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土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数
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土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
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注
意
事
项
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配制微生物培养基时注意事项：（1）溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦；（2）加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度；（3）分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5；（4）一般是培养基先灭菌再倒平板，也可先倒平板,课间再灭菌；（5）冷却后的平板要倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长。
划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。
涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，一面引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。
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不同的微生物培养时所需的温度和培养时间都不同，不能一概而论。例如细菌一般需要在30～37 ℃培养1～2天；放线菌一般在25～28 ℃培养5～7天；霉菌一般在25～28 ℃培养3～4天。
（1）整个过程中要注意无菌操作，一定要建立“有菌观念”，知道杂菌无处不在。对不同的器具要选择不同的灭菌方法。
（2）做好标记：整个操作中所用的培养皿、试管、吸管等都很多，因此要事先做好标记，避免混淆。
（3）规划时间：微生物培养实验都是耗时很长的实验，因此要事先规划好时间，以便提高工作效率。
（4）实验完成后，不同的实验小组要对结果进行比较，如果结果相差很大，一定要分析其原因。
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培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
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2.划线接种的基本步骤和说明
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序列
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操作步骤
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分析说明
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1
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将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红
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将接种环灭菌，避免污染菌种
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2
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在火焰旁冷却接种环，拔除盛有菌液的试管棉塞
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避免杂菌污染菌种
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3
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将试管口通过火焰
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灼烧灭菌，防止试管口菌体污染培养基
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4
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将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取菌液
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冷却接种环可避免杀死菌种
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5
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将试管口通过火焰，并塞上棉塞
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避免试管口杂菌污染菌种
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6
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左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
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初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准
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7
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灼烧接种环，冷却后从第一区划线的末端向第二区划线。重复以上操作，在第三、四、五区划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
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从上个区域的末端向下个区域划线,可逐步分离出单个菌体，从而实现微生物的纯化
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8
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将平板倒置，放入培养箱中培养
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倒置平板防止水分蒸发，也方便拿放
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3.两种“刚果红染色法”比较
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染色法
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优点
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缺点
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方法一
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颜色反应基本上是
纤维素分解菌的作用
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操作繁琐
刚果红会使菌落之间发生混杂
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方法二
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操作简便
不存在菌落混杂问题
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产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，
有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。
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