北京唯尚立德公司拥有人类miRNA mimics 及antagomir文库(1000×2),小鼠miRNA mimics及antagomir文库(600×2),大鼠miRNA mimics及antagomir文库(500×2)。这些文库可以应用于大规模高通量筛选,助力广大科研同仁系统、高效的研究功能,完成项目。 服务内容: 情景一:鉴定miRNA的靶基因 一、萤光素酶(Luciferase)双萤光报告基因实验鉴定miRNA靶点 a、实验概述: 构建包含miRNA靶位点的luciferase报告基因,与miRNA mimics共转到细胞当中,通过荧光素酶活性检测,即可分析出miRNA对潜在靶基因的调控作用,可用于miRNA调控潜在靶基因的验证。既可以小规模实验,也可高通量筛选。 原理图: 图 1-1 b、步骤流程: 1.预测miRNA的靶基因及靶位点 协助客户利用Targetscan,Pictar,miRNA.org,RNA22等常用软件预测miRNA的binding位点。 2.miRNA靶点鉴定 i、目的片段获得:
ii、Luciferase报告基因构建: 将目的片段组装到报告基因载体,1周,800/个。 iii、miRNA表达载体构建: 2周,可以扩增用于其他实验,800/个。 推荐:miRNA mimics合成:1-2周,2 OD,赠送阴性对照,400/个。(二选一) iv、Luciferase实验: 每个靶点都要做一个对照;每个样品包含内参和三组重复,根据样品数而定周期,400*2/个靶点。 成功实例: 图 1-2 二、Luciferase突变实验鉴定miRNA靶点 a、实验概述: 对于前面有效果的miRNA靶基因,将miRNA的binding位点,尤其是seed区突变掉,造成miRNA无法结合,检测luciferase信号是否恢复。原理图:(如图1-1) b、步骤及流程 1.Luciferase报告基因构建:PCR法,每段突变20个碱基之内,1-2周 2.Luciferase实验:每个样品包含内参和三组重复,根据样品数而定周期。 成功实例: 图 1-3 三、mRNA水平鉴定miRNA靶点 a、实验目的:由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的mRNA水平变化将作为一个参考数据,用于分析miRNA作用靶点基因的机制。 b、实验概述:对于前面有效果的miRNA靶基因,检测mRNA水平是否被miRNA下调。 c、具体内容:将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时候,提取RNA,荧光定量PCR检测靶点基因的mRNA水平。900/个靶点+900/对照,2个靶点起订。 四、Western Blot实验鉴定miRNA靶点 a、实验目的:由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的蛋白水平变化将作为一个参考数据,能全面反映靶点基因的蛋白表达水平的变化,结合mRNA表达水平变化,有助于分析miRNA作用靶点基因的机制。 b、实验概述:对于前面有效果的miRNA靶基因,检测蛋白水平是否被miRNA下调。 Western Blot实验:每个样品包含内参,客户提供一抗。 c、具体内容: 将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时后,裂解细胞进行Western Blot检测靶点蛋白的水平变化。800/个靶点+800/对照,2个靶点起订。 成功实例: 图 1-4 五、使用靶基因的siRNA验证靶点 实验概述: miRNA过表达会引起细胞表型的变化,例如迁移、增殖、凋亡,以及靶基因下游基因表达量变化等等。为了证明miRNA是通过负调控靶基因而引起的这些变化,可以使用靶基因的siRNA,检测是否会引起同样的变化。 详见基因沉默服务内容。 六、使用miRNA的抑制剂(Antagomir)验证靶点 原理:miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂,通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合,阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对,抑制miRNA发挥作用。 优势:与普通抑制剂相比,miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果,且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。(Antagomir的合成:单链的特殊修饰的RNA,2 OD) 实验概述:对于内源有表达的miRNA,可以使用Antagomir,检测靶蛋白表达量是否恢复,检测是否会引起过表达miRNA相反的变化。对于内源没有表达的miRNA,可以先构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。 七、通过rescue靶蛋白检测功能来验证靶点 实验概述:对于内源有表达的miRNA,可以构建cDNA表达质粒,过表达靶蛋白,检测是否会有rescue miRNA的抑制效果。对于内源没有表达的miRNA,可以构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。 八、miRNA靶基因信号通路总结 概述:利用prePPI,KEGG等生物信息学软件,总结性分析miRNA调控靶基因及下游信号通路。 成功实例: 图 1-5 情景二:已知现象,未知miRNA,发现您感兴趣的miRNA 内容:利用高通量筛选手段,针对您感兴趣的现象或者细胞行为,筛选出与此相关的miRNA。 详情见高通量筛选服务内容。 情景三:已知基因,鉴定调控它的miRNA 内容:构建包含目的基因3’UTR的luciferase报告基因,与候选miRNA mimics共转到细胞当中,通过荧光素酶活性检测,即可分析出miRNA对目的基因的调控作用,既可以小规模实验,也可高通量筛选。 |
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