测序过程常见问题分析与解答DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?与测序引物有关的问题:答:对于通用测序引物,只要正确使用,一般不会有太大问题,测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序,以下几种PCR引物将是不适 合用作测序引物的:通常用于测序的引物纯度要在90%以上,引物纯度低时,测序反应的背景将 明显增大,直接影响到测序结果。
添加完接头序列后的DNA片段集合叫DNA文库 (DNA library),这样就完成了样品准备工作。首先,引物会与样品中的DNA片段的接头序列互补配对,固定在通道表面。荧光发射波长与信号强度一起决定了碱基的读出,所有的DNA片段的一个碱基会被同时读取。加入化学试剂将叠氮基团与荧光基团切除,然后 Flowcell 再通入荧光标记的dNTP和酶,由引物起始开始合成一个碱基。index 片段引物被引入并与模板杂交,完成序列读取后被洗去。
SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序SOLiD测序三者比较Roche/454测序技术读取长度(600~1000bp),在3种测序技术中最长,可以对未知基因组进行从头测序,但其通量最低(0.5~1Gb/run)。将磁珠与测序试剂加入PTP中,使之可用于上机测序。Solexa测序Fastq:Fastq是Solexa测序技术中一种反映测序序列的碱基质量的文件格式。
高通量测序技术(High-throughputsequencing,HTS)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。第三代测序技术也叫从头测序技术,即单分子实时DNA测序。
illumina SBS测序详解。1. 测序引物(sequencing primer)结合到靠近P5的测序引物结合位点1(sequencing primer binding site 1)上,在系统中加入四种dNTP和DNA聚合酶。前面介绍的都是paired-end的测序,而single-end测序方式是只将index,sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端,另一端直接连上P5/P7,将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇,然后单端测序读取序列。
Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发,利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结(reversible terminator)”,实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Genome Analyzer技术的基本原理:需要样品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng,能应用在很多样品有限的实验(比如免疫沉淀、显微切割等)中。单个或配对末端支持Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。
在前两期《质粒构建:从入门到精通之初窥门径》、《质粒构建:从入门到精通之上下求索》(点标题跳转)中给大家介绍了质粒构建的一些基本知识,在本期中将继续为大家带来质粒构建相关的干货,在本文中将为大家简单介绍一下Kozak序列,并教大家如何在构建质粒之时添加Flag/HA等标签、如何判断该载体上的酶切位点是否有移码以及如何添加碱基避免移码等知识。Kozak序列。该序列被后人称为Kozak序列,并被应用于表达载体的构建中。
对于这种情况,可设置二步PCR,先用较低浓度的引物进行初级PCR,此时由于引物少,形成引物二聚体的可能减少,但它并不影响靶序列的扩增,只是由于引物少产量不高。巢式PCR也是进行二步PCR,与增效PCR不同的是,第二步PCR需应用另外的PCR引物,并另行设置反应体系,此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧,用初级PCR产物做模板,进行第二步PCR,这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。六、不对称 PCR(asymmetric PCR)
2.引物长度一般在15~30碱基之间。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。对于引物,你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
PCR引物设计的原则PCR引物设计的原则(转载)PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合,不与其他非目的DNA结合,PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸,可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。对于较长引物,Tm值则需要考虑热动力学参数,从"最近邻位"的计算方式得到,这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃引物与PCR.选择两个引物3''端与同一非目的基因不同源的序列作为引物。
③ 将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处,再加入适量的DNA连接酶,使质粒与目的基因结合成重组质粒。(4)抗四环素基因不仅在质粒A上,而且它的位置正是目的基因插入之处,因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时,此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏,含重组质粒的受体细胞就不能在含四环素的培养基上生长,而质粒A上无目的基因插入的,抗四环素基因结构是完整的,这种受体细胞就能在含四环素的培养基上生长。
测序的平台上有几万个小井,单个DNA聚合酶和要测序的DNA链固定在每一个小井里。MiSeq 企业:Illumina推出时间:2011年主流型号:MiSeq Personal Sequencing System测序原理:边合成边测序这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面,这些DNA片断通过延长和桥梁扩增,形成了具有数以亿计cluster的Flowcell,每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板,然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
或直接在PCR产物5''端加上测序接头Forward primer(Primer A-key):5''-测序接头(30b)+模板特异序列-3''Reverse primer(Primer P1-key):5''-测序接头(23b)+模板特异序列-3''2)基因组DNA文库:DNA样品通过物理作用打碎成200~300bp的小片段,通过试剂盒在模板片段两端加上测序接头,完成文库的构建测序接头上标记有生物素,用于下一步纯化2.一个DNA片段 = 一个磁珠 每一个单链DNA片段被固定在一个磁珠上,进行乳液PCR形成簇。
PCR是聚合酶链式反应的简称,指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应,是模拟体内DNA复制过程,在体外特异性扩增DNA片段的一种技术,在分子生物学中有广泛的应用,包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA链互补的新链。
PCR引物的设计原则 PCR引物的设计原则: ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。6.引物自身引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。
其中在第一步目的基因获取部分之前的内容意在指出获取目的基因的三种方法,即从基因文库中获取目的基因、利用PCR扩增目的基因、人工合成目的基因。在教学中我们对这个示意图往往可能形成这样的理解偏差:① PCR扩增的模板就是目的基因(从上述第一个内容中可以看出作为模板的可以是包含目的基因的DNA或cDNA)②这个过程中每次循环目的基因都可以增加一倍③合成引物必须要知道目的基因的全部序列④整个过程必须三段温度等等。
引物设计。围绕这几条基本原则,设计引物需要考虑诸多因素,如引物长度(primerlength)、产物长度(product length)、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构(duplexformation and hairpin)、错误引发位点(false priming site)、引物及产物GC含量(composition),有时还要对引物进行修饰,如增加限制酶切点,引进突变等。定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。
试解NGS接头二聚体测序图谱。或者文库的局部碱基序列一样(如PCR引物、接头、barcode等部位);尽管有这么多分子,但是每个DNA分子的碱基序列是一样的,是一组克隆,其测序图谱是这样的,就像一个分子一样:其测序图谱:假设一个文库的前70个碱基序列一模一样,后80个碱基各不一样,测序图谱就是下图这样:把read 1和read 2按顺序排列,中间再加上一段7碱基或者9碱基的barcode read,得到下图(为了简化,只显示一种碱基):
基于Taqman基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒。引物对 上、下游引物终浓度分别为150 ~ 350nM ;[0039] 实施例6采用Express 3.0 设计Taqman-MGB 探针,在ARMS 上游引物的正义链(识别ARMS 引物扩增产物正义链)和反义链(识别ARMS 引物扩增产物反义链)突变位点设计Taqman-MGB 探针,正义探针的核苷酸序列为ttgggggggccaaa(SEQ ID No :8),反义探针的核苷酸序列为tttggcccccccaa(SEQ ID No :9)。
①.模板DNA的变性:模板DNA经加热至90~95℃一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合。③.引物的延伸:DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP为反应原料、靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。PCR反应的物质主要有五种:引物、酶、dNTP、模板和含Mg2+的缓冲液,它们被称为PCR反应的五大要素。
有时为了增加多态性,常常采用一个SSR序列和一个随机引物组成的引物对,这样就又获得了另一种与SSR相关的标记,这种标记一端可以锚定在SSR序列中,另一端则可以通过随机引物来筛选,同一个SSR序列引物与不同的随机引物组合,可以获得各种各样的组合,从而得到更多的多态性。一般来说,ISSR引物为通用引物,不像SSR引物那样需要根据物种基因特征合成引物。结果表明,在可扩增的78个ISSR引物中,7个ISSR引物的扩增产物表现出DNA多态性。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是________。在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,因此,要了解PCR原理,首先要分析细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物I延伸而成的DNA单链会与引物II结合,进行DNA的延伸,这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。
基因的特性有DNA碱基序列决定,DNA序列分析(SEQUENCING)是分子生物学研究的重要手段和进一步认识、改造目的的基因的基础。检测的时候,把受检者的DNA从其血液、口腔黏膜或其它细胞样品中提取出来,然后用PCR技术将待检测的基因片段定位并大量复制,最后根据不同的基因突变情况采用基因测序、SNP分型,凝胶电泳等方法判断待测基因的基因型,从而对相应疾病的患病风险进行预测或对不同药物在体内的强弱代谢进行分析。
宏基因组学(又称元基因组学,环境基因组学,生态基因组学等),是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质的学科。什么是功能基因组学 功能基因组学(Functuionalgenomics)又往往被称为后基因组学(Postgenomics),它利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。
Jonasson等运用焦磷酸测序技术通过检测病原菌16S rRNA基因,快速鉴定临床标本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因(16S rDNA)易变的Vl和V3区序列,证明该技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型;Unnerstad等利用该技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型,在短时间内完成大量的样本测序,其并行性和高效率非常显著,如果用常规的测序技术,工作量会很大。
RNA高通量测序(RNA-sequencing,缩写为RNA-seq)是目前高通量测序技术中被用得最广的一种技术,RNA-seq可以帮助我们了解:各种比较条件下,所有基因的表达情况的差异。目前,外显子测序的主要优势就体现在肿瘤基因测序方面,之所以外显子测序在肿瘤基因测序方面有优势呐,这是因为外显子测序,它的测序深度,可以比较容易地做到“深度”测序。这张图是:大量细胞测序、MDA方法测序、MALBAC方法测序,这三种测序结果的Lorenz曲线。
分子标记技术主要可以分为两类, 基于杂交的标记技术和基于PCR 的标记技术。SRAP 标记的引物设计。SRAP 标记分析中共有两套引物, 长为17 bp 的正向引物和长为18 bp 的反向引物, 也有用19 bp 反向引物的。通过改变3''端3 个选择性碱基可得到更多的引物, 同时由于正向引物和反向引物可以自由组配, 因此用少量的引物可进行多种组合, 大大减少了合成引物的费用, 同时也大大提高了引物的使用效率。
TaqMan探针法通过设计PCR引物和针对于位点的荧光探针实现对SNP的分型检测,适合少量SNP位点的分析。该技术使用引物扩增目标SNPs所在片段,使用测序酶、四种荧光标记ddNTP和 5'' -端紧靠SNP位点的延伸引物进行PCR反应,引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型,对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。
微生物多样性研究时,该如何选择测序平台?在本文中进行详细介绍。
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