分子克隆的正确打开方式 | 质粒专题（二）

之前在推文中讲述了分子克隆的有关培养基的问题，那么在分子克隆实验中还有有关质粒的问题是实验研究的必备技能之一，原始质粒的扩增或者外源片段与载体连接的克隆质粒都需要进行质粒转化，使其繁殖，筛选阳性质粒后得到就能获得大量质粒。因此将质粒 DNA 导入细菌的过程称为转化，目的就是增加质粒的数量。

质粒转化原理

大肠杆菌在CaCl 2低渗溶液中膨胀为球状，形成感受态细胞（如DH5α，TOP10）。外源质粒 DNA 与 CaCl 2 形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细菌表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进感受态细胞吸收 DNA 复合物。在LB固体培养基上生长12-16小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培养平板上，可选出所需的克隆质粒。

质粒常规转化实验方法与步骤

1

取一个1.5ml离心管，加入50μl感受态细胞悬液，置冰上。加入50-100ug质粒，用移液器轻柔混匀。冰上静置20min。

2

将EP管先放于42℃水浴中热激30-40秒，然后迅速置冰上3~5min。整

个过程不要振荡菌液。

3

加入500ul LB液体培养基(一定不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

4

制备含有Amp抗生素的LB平板。

5

取100ul菌液，将液体滴加至含有抗生素Amp的LB固体培养基平板上，用三角玻璃棒均匀涂抹。

6

37℃培养箱内正置15分钟， 待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，次日可见均匀分布的阳性克隆。挑取单克隆菌落后，送公司测序，验证是否为阳性筛选质粒。或者直接挑取菌落后，加至含有抗生素的液体LB肉汤中摇菌，获得大量菌液后提取质粒。

目前市面上也有一些快速转化感受态细胞。转化过程不需要冰浴、热敷和孵育等步骤，比如有些感受态细胞实现了五分钟转化：

1.  取一个1.5ml离心管，加入50μl感受态细胞悬液，置冰上2分钟。

2.  42度热激30s。

3.  置冰上2分钟。

4.  加入200ulLB液体培养基后，均匀涂抹于37度预热的抗生素LB固体平板。注意，此时LB固体平板一定要先放于37度培养箱中预热。